联合应用胰岛素与艾迪苯醌对糖尿病大鼠血脑屏障通透性的影响及机制研究

摘要

目的:
　　糖尿病是以慢性高血糖及多器官系统并发症为特征的疾病，治疗的主要目的是降低血糖，减少或延缓症状及并发症的发生发展。糖尿病脑病是糖尿病常见的并发症之一。在糖尿病脑病的发生发展过程中，血脑屏障结构和功能的改变可能是糖尿病脑病早期的病理生理学改变之一。血脑屏障结构的破坏、通透性的增加，神经元在高血糖、以及高血糖引起的氧化应激、炎症因子等一系列因素刺激下，发生凋亡、变性、甚至坏死。有报道证明糖尿病是神经系统退行性病变以及痴呆发生的危险因素，降糖药物的使用可以减缓退行性病变的发生和发展，但对于胰岛素等降糖药物对糖尿病血脑屏障功能的作用尚无一致性报道。紧密连接蛋白是保持血脑屏障完整性的结构基础，在紧密连接相关蛋白家族中，occludin、claudin-5是两个代表性分子，有报道脑微血管内皮细胞的紧密连接相关蛋白occludin、claudin-5的表达减少与血脑屏障通透性的增加相关。
　　糖尿病时的高血糖状态，使细胞产生氧化应激反应。氧自由基的产生增加，诱导多种炎性因子产生增加，增加了细胞毒性作用，使血管内皮细胞及神经细胞等损伤。维生素E、姜黄素作为抗氧化剂在实验性糖尿病大鼠的治疗中显示出了对抗减少自由基产生起的DNA和蛋白质损伤，从而保护糖尿病大鼠神经元和上皮细胞功能的作用。艾迪苯醌是一种临床上使用的抗氧化剂，目前尚无艾迪苯醌对糖尿病血脑屏障影响方面的报道。
　　本文旨在研究探讨胰岛素与艾迪苯醌单独及联合应用对糖尿病大鼠血脑屏障的影响及其可能机制，为糖尿病的血管神经病变的治疗提供新的实验依据。
　　方法:
　　1、链脲菌素诱导的糖尿病大鼠模型的复制及实验分组
　　成年雄性Wister大鼠，禁食不禁水12小时后给予一次性腹腔注射1.3％（溶于柠檬酸盐缓冲液pH值4.2-4.5）链脲菌素(streptozotocin，STZ)60mg/kg体重，以给药2周后血糖值不低于16.7mol/l的大鼠做为糖尿病大鼠。随机分为糖尿病组、胰岛素给药组、艾迪苯醌给药组、胰岛素与艾迪苯醌联合应用组，并设空白给药组（等剂量生理盐水腹腔注射）做为对照。
　　2、胰岛素及艾迪苯醌给药
　　给予链脲菌素2周后大鼠用药各组给予治疗用药，胰岛素给药组给予胰岛素8U/kg，日两次腹腔注射;艾迪苯醌给药组给予艾地本醌30mg/kg，日一次灌胃给药;胰岛素与艾迪苯醌联合给药组给予胰岛素与艾迪苯醌同时给药。体重及饮水随时监测，血糖监测采用尾尖取血法利用血糖仪进行监测。
　　3、伊文氏兰渗透实验检测血脑屏障通透性
　　伊文氏兰(Evans blue,EB)渗透试验用来检测链脲菌素诱导的糖尿病大鼠血脑屏障通透性的变化，空白组做对照。选择STZ给药前，STZ造模2周，STZ造模4周，STZ造模8周，STZ造模12周做为时间观察点检测糖尿病大鼠血脑屏障通透性变化;给予STZ造模2周后，给予胰岛素及艾迪苯醌治疗用药，以治疗2周、6周、10周为时间观察点采用EB渗透试验检测胰岛素及艾迪苯醌对血脑屏障通透性影响。
　　4、Western blot实验
　　治疗用药10周提取大脑皮质血管，提取蛋白样品应用western blot实验检测occludin，claudin-5蛋白表达。取大脑皮质血管蛋白检测糖基化终术产物受体(receptor for advanced glycation end product，RAGE)蛋白表达，应用试剂盒提取大脑皮质血管核蛋白检测脑皮质NF-κB P65蛋白表达。
　　5、透射电镜观察
　　治疗用药10周取材，应用电镜检测大鼠血脑屏障超微结构变化。
　　6、ELISA实验
　　治疗用药10周取材，提取大鼠脑皮质应用酶联免疫吸附实验(Enzyme-LinkedImmunosorbent Assay, ELISA)检测脑皮质晚期糖基化终术产物(advancedglycation end products，AGEs)含量。
　　7、统计分析
　　SPSS11.0软件分析实验结果，实验结果采用means±SD.两两比较采用t检验。多组比较采用单因素方差分析，多重比较P＜0.05认为有显著性差异。
　　结果:
　　一、胰岛素与艾迪苯醌联合应用对糖尿病大鼠血脑屏障的影响
　　1、伊文氏兰渗透试验检测血脑屏障通透性显示糖尿病大鼠血脑屏障通透性随糖尿病病程进展变化
　　STZ给药2周和4周时，糖尿病组与对照组相比血脑屏障通透性有增高趋势，但无统计学差异。STZ给药8周和12周时，糖尿病组与对照组相比血脑屏障通透性显著增高。
　　2、胰岛素与艾迪苯醌联合应用增加糖尿病大鼠体重
　　与对照组相比，治疗前，治疗2周、6周、10周各时间点，糖尿病组与对照组相比体重显著降低;与糖尿病组相比，在治疗2周、6周、10周时间点，胰岛素组、艾迪苯醌组、胰岛素与艾迪苯醌联合应用组均显著增加了大鼠的体重。
　　3、胰岛素与艾迪苯醌联合应用降低糖尿病大鼠饮水量
　　与对照组相比，在治疗前，治疗2周、6周、10周各时间点，糖尿病组与对照组相比饮水量显著增加;与糖尿病组相比，在治疗2周、6周、10周时间点，胰岛素组、艾迪苯醌组、胰岛素与艾迪苯醌联合应用组均显著降低了大鼠的饮水量。
　　4、胰岛素与艾迪苯醌联合应用降低糖尿病大鼠血糖
　　与对照组相比，在治疗前，治疗2周、6周、10周各时间点，糖尿病组和艾迪苯醌组分别与对照组相比血糖均显著增加;与糖尿病组相比，在治疗2周、6周、10周时，胰岛素组和胰岛素与艾迪苯醌联合应用组的血糖值均显著降低，艾迪苯醌组的血糖值未见明显变化。
　　5、胰岛素与艾迪苯醌联合应用降低糖尿病大鼠血脑屏障通透性
　　在治疗前和治疗2周，对照组、糖尿病组、胰岛素组、艾迪苯醌组、胰岛素与艾迪苯醌联合应用组各组间的EB含量无统计学意义的变化;在治疗6周，与对照组相比，糖尿病组和艾迪苯醌组的EB含量分别显著增高;与糖尿病组相比，胰岛素组、胰岛素与艾迪苯醌联合应用组显著降低了EB含量;在治疗10周，与对照组相比，糖尿病组、胰岛素组、艾迪苯醌组、胰岛素与艾迪苯醌联合应用组的EB含量均显著增加;与糖尿病组相比，胰岛素组、艾迪苯醌组、胰岛素与艾迪苯醌联合应用组的EB含量均显著降低。
　　6、胰岛素与艾迪苯醌联合应用保护血脑屏障的完整性
　　对照组的脑微血管内皮间的紧密连接致密，处于关闭状态，糖尿病组紧密连接处于轻微的开放状态，胰岛素组、艾迪苯醌组及联合给药组电镜下的紧密连接均接近于对照组，处于关闭状态。
　　7、胰岛素与艾迪苯醌联合应用上调糖尿病大鼠大脑微血管段occludin和claudin-5蛋白表达
　　与对照组比较，糖尿病组、胰岛素组、艾迪苯醌组、胰岛素与艾迪苯醌联合应用组的大鼠脑微血管段occludin的表达均显著降低;与糖尿病组相比较，胰岛素组、艾迪苯醌组、胰岛素与艾迪苯醌联合应用组分别显著增加了occludin的表达。与对照组比较，糖尿病组、胰岛素组、艾迪苯醌组、胰岛素与艾迪苯醌联合应用组的大鼠脑微血管段claudin-5的表达均显著降低;与糖尿病组相比较，胰岛素组、艾迪苯醌组、胰岛素与艾迪苯醌联合应用组分别显著增加了claudin-5的表达。
　　二、胰岛素与艾迪苯醌联合应用对链脲菌素诱导糖尿病大鼠血脑屏障的影响机制研究
　　1、胰岛素与艾迪苯醌联合应用降低糖尿病大鼠脑微血管段AGEs含量
　　与对照组相比，糖尿病组、胰岛素组、艾迪苯醌组、胰岛素与艾迪苯醌联合应用组的AGEs含量均显著增加;与糖尿病组相比，胰岛素组、艾迪苯醌组、胰岛素与艾迪苯醌联合应用组的AGEs含量均显著降低
　　2、胰岛素与艾迪苯醌联合应用降低糖尿病大鼠脑微血管段RAGE，NF-κB P65的蛋白表达
　　与对照组相比，糖尿病组、胰岛素组、艾迪苯醌组、胰岛素与艾迪苯醌联合应用组的RAGE蛋白表达均显著增加;与糖尿病组相比，胰岛素组、艾迪苯醌组、胰岛素与艾迪苯醌联合应用组的RAGE蛋白表达均显著降低。与对照组相比，糖尿病组、胰岛素组、艾迪苯醌组的NF-κB蛋白表达均显著增加;与糖尿病组相比，胰岛素组、艾迪苯醌组、胰岛素与艾迪苯醌联合应用组的NF-κB蛋白表达均显著降低。
　　结论:
　　1、胰岛素与艾迪苯醌单独以及联合应用分别显著增加了糖尿病大鼠的体重，降低了饮水量，胰岛素及联合应用降低了糖尿病大鼠的血糖值。
　　2、胰岛素与艾迪苯醌单独以及联合应用分别显著降低了糖尿病大鼠的血脑屏障通透性;胰岛素与艾迪苯醌联合应用在降低糖尿病大鼠血脑屏障通透性上存在协同作用。
　　3、胰岛素与艾迪苯醌单独以及联合应用分别显著增加了糖尿病大鼠的脑微血管段occludin和claudin-5的蛋白表达，胰岛素与艾迪苯醌联合应用在增加紧密连接相关蛋白occludin上存在协同作用。
　　4、胰岛素与艾迪苯醌单独及联合应用显著降低了糖尿病大鼠脑微血管段AGEs和RAGE以及核NF-κB蛋白表达。胰岛素与艾迪苯醌单独及联合应用在降低上述三个蛋白表达上存在协同作用。抑制AGEs/RAGE/NF-κB途径是胰岛素与艾迪苯醌单独及联合应用降低血脑屏障通透性的机制之一。

目录

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摘要

英文缩略语

论文一 联合应用胰岛素与艾迪苯醌对糖尿病大鼠血脑屏障通透性的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

论文二 联合应用胰岛素与艾迪苯醌降低糖尿病大鼠血脑屏障通透性的机制初探

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 糖尿病血脑屏障结构和功能的改变的研究进展

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