大鼠神经管畸形胚胎期神经元缺损机制及羊膜腔内骨髓间充质干细胞移植治疗潜能的研究

摘要

目的：
　　 神经管畸形(Neural tube defects，NTDs)是最常见、最严重的中枢神经系统先天性畸形，世界范围内发生率为0.5％-20％，但目前尚无良好治疗方法。脑积水、下肢功能障碍以及尿便失禁依然是严重的术后神经系统后遗症，这主要是由于神经损伤后修复极其困难造成的。我们前期的的研究证明支配肛门外括约肌和肛提肌的脊髓运动与感觉神经元以及支配直肠的副交感神经元在NTDs大鼠胚胎期便存在明显发育异常。因此，研究NTDs神经元发育损伤的机制，然后在神经出现不可逆损伤之前给予治疗，为神经管畸形的早期治疗提供基础，对减少出生缺陷、提高人口素质具有极其重要的意义。
　　 方法：
　　 1、动物模型建立与标本收集
　　 成熟未孕Wistar大鼠雌雄比例5∶1午夜合笼，次日晨8-9时阴道涂片，显微镜下见到精子记为embryonic day0(E0)。E10天已孕雌鼠随机分为全反式维甲酸(all-trans retinoic acid, atRA)致畸组和正常对照组两组。用橄榄油将atRA溶解成40mg/ml的混悬液，atRA致畸组以150mg/kg剂量经胃管灌入，对照组给予等体积的橄榄油。分别于E11，E12，E13，E15和E18时剖宫取出胎鼠，解剖显微镜下辨认畸形，4％多聚甲醛固定或取出胎鼠脊髓，-80℃保存。
　　 2、细胞凋亡、细胞增殖与细胞分化的染色分析
　　 全胚胎TUNEL染色
　　 胚胎固定后脑室打孔，10μg/ml的蛋白激酶K，37℃孵育7 min-15min。含0.3％曲拉通x-100的磷酸盐缓冲液(0.3％ Triton x-100 in phosphate-buffered saline，PBST)冲洗后于含0.3％曲拉通x-100的枸橼酸钠溶液中冰浴3h，胚胎在TUNEL反应液中37℃避光孵育2.5 h-3.5h。然后将胚胎置入过氧化物酶标记的抗FITC抗体(POD)溶液中4℃过夜，最后DAB显色，反应3-10min，镜下观察。
　　 切片TUNEL染色
　　 胚胎石蜡切片脱蜡复水，15μg/ml蛋白酶K37℃孵育10min并于含0.1％曲拉通-x的枸橼酸钠溶液中冰浴2min; TUNEL混合液中37℃避光反应1.5h; DAPI复染，镜下观察，激光共聚焦显微镜采集结果图像。
　　 免疫荧光染色
　　 胚胎石蜡切片进行脱蜡、复水，或者冰冻切片置于PBS浸泡5min，然后没入枸橼酸钠进行热抗原修复;10％血清封闭，室温30min;一抗4℃，过夜;罗丹明或488标记的荧光二抗IgG，室温2.5h; DAPI复染，镜下观察，激光共聚焦显微镜采集结果图像。
　　 3、Real-time quantitive reverse-transcription PCR(qRT-PCR)检测脊髓组织神经元发育相关microRNAs(miRNAs)的表达
　　 (1)提取总RNA:按照ambion的mirVana miRNA Isolation Kit说明进行RNA抽提，采用两步加A法、特异性stem-loop RT引物法两种方法进行real-time PCR。
　　 两步加A法:
　　 (1)反转录:RNA加A尾后采用40μl反应体系反转录(5×prime script buffer,8μl; Prime script RT enzyme,1μl; RT primer,2μl; Total RNA,29),37℃孵育15min,85℃5 sec终止反应。
　　 (2) real-time PCR反应:调整cDNA浓度为500 ng/μl，20μl反应体系(SYBRRPremix Ex TaqTM(2×),10μl; PCR primer(5μM),2μl; H2O,5.6μl; ROXⅡ,0.4μl;eDNA，1μl)，反应条件为:Stage1预变性:95℃30 sec; Stage2 PCR反应:95℃5 sec，60-61℃30 sec，40个循环;Stage3融解曲线分析:95℃0 sec，60-61℃15sec，95℃20 sec。每个样本行3个平行孔重复实验，采用2-△△Ct的方法分析目的基因的相对表达量。
　　 Stem-loop RT引物法进一步分析miR-9*和miR-124a的表达
　　 (1)反转录:采用15μl反应体系反转录(100mMDntp，0.15μl; MultiCribeTMReverse Transcriptase,1.00μl; Reverse Transcription Buffer(10×),1.50μl; RNaseInhibitor,0.19μl; RT primer(5×),3.00μl; Raase Free H2O,4.16μl; Total RNA,5.00μl)，16℃30 min，42℃呼育30 min，85℃5min终止反应，-4℃保存。
　　 (2) real-time PCR反应:20μL体系反应体系如下:(Universal PCR Master Mix(2×),10μl; TaqMan MicroRNA Assay(20×),1μl; H2O,7.7μl; cDNA,1.3μl)，反应条件为:Stage1 UTPase灭活:50℃2min; Stage2预变性:95℃10min; Stage3 PCR反应:95℃15 sec，60℃60 sec，45个循环。计算表达量同上。
　　 4、qRT-PCR检测脊髓组织中miRNA调控的染色体重构复合物相关基因mRNAs的表达
　　 (1)总RNA标本同miRNAs qRT-PCR.
　　 (2)反转录:采用20μl反应体系反转录（5×prime script buffer,4μl; Prime scriptRT enzyme,1μl; Oligo dT primer,1μl; Radome6mers,1μl; Raase Free H2O,11μl;Total RNA，2μl)，37℃孵育15min，85℃5 sec终止反应。
　　 (3) real-time PCR反应同两步加A法miRNA real-time PCR，β-actin作内参。
　　 5、骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)分离培养
　　 取体重60-90克的Wistar大鼠，无菌条件下取股骨，用20ml增殖培养基DMEM/F12(1∶1)+10％胎牛血清冲洗骨髓腔，制作骨髓细胞悬液，全骨髓贴壁法分离骨髓间充质干细胞，5％ CO2，37℃恒温培养箱中进行传代培养。
　　 绿色荧光蛋白标记骨髓间充质干细胞，转染腺病毒-5F35-enhanced GeneFluorescent Protein(eGFP)，24h后荧光显微镜下确定绿色荧光蛋白表达情况，计数GFP阳性细胞数，消化，吹打，离心后制成2000-3000个/μl的细胞悬液。
　　 6、利用大鼠胚胎体外培养进行维甲酸体外致畸
　　 孕鼠E10时剖腹取胎，保留完整卵黄囊和胎盘，维甲酸用DMSO溶解，胚胎随机分为正常对照组、1μM、3μM维甲酸处理组，分别置于含不同浓度维甲酸的100％大鼠即刻离心血清中37℃，不同O2浓度下旋转培养，24h后，更换新鲜培养基，弃掉维甲酸。于54h后终止培养，镜下辨认畸形并进行形态学打分，4％多聚甲醛固定。
　　 7、体外进行羊膜腔内MSCs注射
　　 于不同的培养时间点对各组胚胎进行羊膜腔内MSCs注射，显微注射针于胚胎背侧避开卵黄囊血管发生部位进入羊膜腔，将0.2μl干细胞悬液或者空白培养基注射入胚胎羊膜腔内，注毕羊膜腔仍为充盈状态则成功，继续培养48-54h。
　　 体式荧光显微镜下观察MSCs的迁移存活情况并采集图像，观察干细胞的趋化规律。收获的胚胎4％多聚甲醛固定后冰冻切片，-80℃保存。
　　 8、统计分析
　　 数据以均数±标准差表示，采用SPSS13.0软件对实验数据进行t检验和SNK-q检验，以P值表示统计差异，P＜0.05认为差异有统计学意义。
　　 结果：
　　 1、先天性脊柱裂大鼠模型
　　 本研究成功制作先天性脊柱裂大鼠动物模型，维甲酸以150mg/kg剂量给药，显性脊柱裂发生率为49％。
　　 2、细胞增殖与细胞凋亡染色结果
　　 全胚胎TUNEL染色显示在E11脊柱裂胚胎中，细胞凋亡于多个发育部位明显增多，集中表现在颅面原基、颅部神经管的背外侧、骶尾部神经管的背部中线，而E12及E13脊柱裂胚胎中，过度增多的细胞凋亡仅在骶尾部神经管的背部中线处可见。
　　 骶尾部切片TUNEL染色显示E11和E12胚胎中，细胞凋亡主要集中在神经管背部中线处，而细胞凋亡在E13胚胎神经管背腹侧均有分布。在E11，E12和E13正常胚胎中，神经前体细胞的凋亡率随着胚胎发育逐渐升高。而脊柱裂组胚胎畸形发生部位的神经前体细胞的凋亡率明显高于正常对照组，并且细胞凋亡异常在E12胚胎中表现更为明显(P＜0.001)。
　　 在正常组胚胎中，神经前体细胞增殖率随着胚胎的发育明显降低。而在脊柱裂组，细胞增殖在E11与E12胚胎中并无明显区别，在胚胎发育的第13天开始降低，并且畸形发生部位神经前体细胞的增殖率明显低于正常对照组(P＜0.001)。
　　 TUNEL和pH3免疫荧光双染显示，在E11和E12脊柱裂胚胎中，细胞凋亡主要在神经管背部中线处增多，而细胞增殖的减少主要发生在神经管的中央管腔。而在E13脊柱裂胚胎神经管中，细胞凋亡和增殖的异常都沿着神经管的背腹轴均匀分布(图1-4)。
　　 3、qRT-PCR检测神经元发育相关miRNAs表达的结果
　　 与给药无畸形对照组相比，miR-9/9*和miR-124a的表达在E12脊柱裂组胚胎脊髓中明显降低，而miR-10a，miR-10b，miR-34a，miR-221及miR-222的表达无明显变化。
　　 miR-9*和miR-124a在E12，E13，E15和E18胚胎脊髓中的表达随着胎龄的增加呈现明显上调的趋势。与对照组相比，miR-9*和miR-124a在发育较早期(E12，E13，E15)的脊柱裂脊髓中表达明显降低(P＜0.05);而在E18脊柱裂胚胎中，仅miR-124a的表达明显降低，而miR-9*的表达虽下调但无统计学差异（P＞0.05）。
　　 4、qRT-PCR检测miR-9*和miR-124调控的染色质重构相关基因mRNA表达的结果
　　 与miR-9*和miR-124a的表达趋势一致，随着胎龄增加，miR-9*和miR-124a的上游基因REST表达逐渐下调，下游基因BAF53a表达逐渐降低，BAF53b的表达则大幅度上调。
　　 在脊柱裂组，与对照组相比，我们发现miR-9*和miR-124a的表达水平降低的同时，REST的表达在胚胎发育的第15天显著升高（P＜0.05），而在E12与E13时无明显变化;BAF53a的表达水平在脊柱裂胚胎的不同发育阶段都明显升高(P＜0.05)，而BAF53b的表达量则明显减少（P＜0.05）;同时神经分化相关基因Neuro D1在脊柱裂脊髓中的表达也出现降低(P＜0.05)。
　　 5、维甲酸体外致大鼠胚胎神经管畸形的结果
　　 利用全胚胎培养技术，不同浓度的维甲酸体外24h致畸，成功诱导大鼠胚胎出现露脑畸形、脊柱裂等神经管畸形的表型。并且随着给药量的增多，胚胎神经管畸形的发生率逐渐升高，程度加重，主要表现在神经管未闭合区域增大、露脑畸形合并脊柱裂表型在神经管畸形胚胎中占的比例增多。
　　 6、体外进行羊膜腔内注射MSCs的结果
　　 胚胎经羊膜腔内注射干细胞，并于体外培养48h-54h后，荧光显微镜下可见MSCs在正常胚胎和神经管畸形胚胎中均有存活，主要趋化部位为神经管畸形发生部位及中后脑背部神经管。并且随着移植时间点及胚胎畸形发生部位和程度的不同而不同，移植时间越早，干细胞存活率越高（P＜0.05）;脑部神经管畸形的胚胎中MSCs的存活率明显高于其他组(P＜0.01)，并且畸形程度越重，干细胞存活率越高。
　　 7、移植的MSCs在胚胎中分化的结果
　　 迁移存活到胚胎脑部神经管畸形部位及其周围间质中的MSCs能够表达一些神经特异性标记物，nestin（神经前体细胞）、GPAP（神经胶质细胞）及tubulin（神经元），然而在脊部神经管存活的MSCs仅发现nestin表达。
　　 结论：
　　 1、维甲酸诱导的大鼠脊柱裂胚胎骶尾部神经管中神经前体细胞凋亡增多，而细胞增殖减少，这可能是脊柱裂胚胎神经元发育异常的主要原因之一。
　　 2、不同发育阶段的脊柱裂胚胎脊髓中miR-9/9*和miR-124a的表达明显下调，同时参与染色体重构复合物转换的基因及NeuroD1的表达异常，推测其可能机制是miR-9*和miR-124a的表达量减少抑制染色体重构复合物的转换，影响神经管细胞的增殖与分化，从而参与脊柱裂神经元发育不良的形成。
　　 3、神经管畸形发生早期进行羊膜腔内注射骨髓间充质干细胞，干细胞可向胚胎神经管畸形缺损部位特异性趋化，并能够分化为神经干细胞、神经胶质细胞及神经元，提示神经管畸形早期进行干细胞治疗的可行性。

目录

声明

摘要

英文缩略词

论文一 论文维甲酸诱导显性脊柱裂胎鼠骶尾部神经前体细胞凋亡和增殖的变化规律研究

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

论文二 miR-9*和miR-124a调控的染色体重构复合物在大鼠先天性脊柱裂胚胎中的表达分析

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

论文三 利用全胚胎培养进行羊膜腔内移植骨髓间充质干细胞对大鼠神经管畸形治疗潜能的研究

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

研究创新性的自我评价

参考文献

综述

在学期间科研成绩

致谢

个人简介