BAG3在蛋白酶体抑制剂诱导肝癌HepG2细胞自噬中的作用

摘要

目的:
　　 细胞内蛋白质的降解主要通过两个途径，即泛素-蛋白酶体系统和自噬-溶酶体系统。在较长时间内，这两个降解系统被认为是相互独立、没有交集的平行线。但是近期越来越多研究表明泛素-蛋白酶体系和自噬-溶酶体系统存在广泛而密切的对话，而自噬被认为是蛋白酶体功能削弱后的一种补偿性机制。许多研究表明在不同组织来源的细胞中蛋白酶体抑制剂诱导细胞内自噬水平增加，但是蛋白酶体抑制剂诱导自噬的分子机制并不清楚。
　　 自噬是在其起始信号的调控下，细胞质中形成杯状的双层膜结构的自噬前体;然后，自噬前体在一些自噬蛋白的作用下逐渐延长，包裹降解产物，最终形成完全闭合的自噬泡。在自噬泡形成过程中需要一系列的Atg蛋白发挥作用。根据自噬体形成过程是否需要整套的Atg蛋白，可将自噬分为经典自噬和非经典自噬，其中最为典型的非经典自噬就是不依赖于BECN1的自噬。
　　 BAG3是HSP70的共分子伴侣蛋白，属于应激、存活蛋白，可在应激情况下被诱导表达。BAG3蛋白参与包括增殖、凋亡、黏附、转移以及病毒增殖等在内的一系列生理、病理过程。最近研究发现，BAG3参与错误折叠蛋白被自噬选择性降解的过程，进而发挥调控自噬的作用，使BAG3在自噬的研究领域备受关注。本课题组前期研究表明在甲状腺癌、子宫颈癌、乳腺癌等不同来源的肿瘤细胞中，各种蛋白酶体抑制剂均可在转录水平上调BAG3的表达;而JNK信号通路在蛋白酶体抑制上调BAG3的表达中起关键作用;同时有研究证实JNK信号通路在蛋白酶体抑制剂诱导自噬中也具有关键作用。本研究在已有的研究基础上，利用肝癌HepG2细胞作为研究对象，解析蛋白酶体抑制剂对细胞自噬水平的影响，弄清自噬分属类型以及BAG3蛋白、JNK信号通路在其中的作用;为进一步理解泛素-蛋白酶体系统与自噬-溶酶体系统的交叉对话奠定基础。
　　 方法:
　　 1、培养肝癌HepG2细胞;建立LC3B、-PX-基序、BAG3等稳定过表达的HepG2细胞，BECN1、BAG3稳定被干扰的HepG2细胞。
　　 2、蛋白酶体抑制剂处理肝癌HepG2细胞，采用AO、MDC、Lyso-TrackerTM等荧光染料染色，观察细胞内酸性泡数量及结构的变化;过表达EGFP-LC3B，荧光显微镜观察LC3B点簇状数量及分布变化;透射电镜技术观察细胞亚结构变化，检测自噬体的形成。
　　 3、蛋白酶体抑制剂处理肝癌HepG2细胞，实时RT-PCR技术检测BECN1、BAG3、LC3等基因的mRNA表达水平。
　　 4、蛋白酶体抑制剂单独或联合其他特异性抑制剂处理细胞，采用AO、MDC、Lyso-TrackerTM等荧光染料染色，观察细胞内酸性泡数量及结构的变化;Westernblot检测LC3、BECN1、BAG3、p-JNK、p-RS6KB等蛋白质的表达变化。
　　 5、蛋白酶体抑制剂单独或联合其他特异性抑制剂处理细胞，MTT、苔盼蓝染色、Hoechst33258染色等技术检测蛋白酶体抑制剂对HepG2细胞存活的影响。
　　 结果:
　　 1、蛋白酶体抑制剂BZ、Epox、Lacta、MG132诱导肝癌HepG2细胞自噬体增加，自噬增强。
　　 2、在Ⅲ型PI3K特异性抑制剂存在下，蛋白酶体抑制剂BZ、Epox、Lacta、MG132仍诱导肝癌HepG2细胞自噬，且诱导程度无明显变化。
　　 3、蛋白酶体抑制剂BZ、Epox、Lacta、MG132不同程度降低HepG2细胞BECN1的表达。采用shRNA敲低BECN1的表达，蛋白酶体抑制剂BZ、Epox、Lacta、MG132仍诱导肝癌HepG2细胞自噬，且诱导程度无明显变化。
　　 4、采用shRNA敲低BAG3的表达，蛋白酶体抑制剂BZ、Epox、 Lacta、MG132诱导的自噬水平明显降低。
　　 5、JNK特异性抑制剂明显降低蛋白酶体抑制剂BZ、Epox、Lacta、MG132诱导的自噬，BAG3过表达明显阻碍JNK抑制剂的作用。
　　 6、JNK特异性抑制剂或shRNA敲低BAG3的表达明显增加蛋白酶体抑制剂BZ、Epox、Lacta、MG132诱导的HepG2细胞毒性作用;而BAG3过表达明显抑制蛋白酶体抑制剂BZ、Epox、Lacta、MG132诱导的HepG2细胞毒性作用。
　　 结论:
　　 1、在肝癌HepG2细胞中，蛋白酶体抑制诱导不依赖于BECN1/Ⅲ型PI3K复合物的非经典自噬。
　　 2、在肝癌HepG2细胞中，JNK信号通路通过上调BAG3的表达介导蛋白酶体抑制剂诱导的非经典自噬。
　　 3、在肝癌HepG2细胞中，JNK和BAG3介导的非经典自噬抑制蛋白酶体抑制剂的抗肿瘤作用。

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