谷氨酸诱导小鼠大脑皮层星形胶质细胞ATP释放路径的研究

摘要

前言
　　星形胶质细胞是中枢神经系统的重要组成部分，在神经元的营养与保护、诱导神经干细胞再生、免疫调节、参与信号传导、参与疼痛调节机制等中起到重要作用。星形胶质细胞与神经元之间存在着密切的机构和功能联系，通过神经元兴奋释放的递质可作用于星形胶质细胞，星形胶质细胞受到刺激后也释放递质作用于神经元，调节神经元的兴奋性和突触传递。其中主要的神经递质是谷氨酸与ATP。
　　谷氨酸是一种重要的兴奋性神经递质。星形胶质细胞是谷氨酸摄取、代谢、和循环的主要场所，通过对谷氨酸的释放与重吸收来维持胞外的相对低浓度，以利于突触间兴奋性的传递。但是在脑缺血、缺氧、脑外伤、脑水肿等病理条件下，会造成细胞外高浓度的谷氨酸，产生谷氨酸的兴奋性毒性，加剧细胞和组织的损伤，导致不良结果。
　　ATP是细胞内的供能物质，也是重要的神经递质。星形胶质细胞的ATP释放涉及到一系列的神经元的活动，并且也对自身产生一定的影响。在水肿、机械刺激、谷氨酸和NO刺激等条件下都会发生星形胶质细胞的ATP释放。研究表明星形胶质细胞在低渗或缺血缺氧等条件下，会出现大量的ATP的释放和胞外高浓度聚集，并参与继发性神经细胞凋亡或坏死。
　　ATP和谷氨酸在神经系统的功能活动中，既有各自的作用途径和环节，又有紧密的相互关系，相互影响。既往有关星形胶质细胞ATP或谷氨酸在各种生理或病理情况下对细胞功能活动的影响研究比较多，但二者之间的相互作用关系却很少有报道。所以本研究中，分别观察不同浓度谷氨酸刺激条件下细胞外液中ATP的浓度变化，明确其释放途径，并进一步观察细胞外液中ATP变化对细胞状态的影响。寻找有效的方法减少该条件下细胞内ATP的外流，减少谷氨酸和ATP共同作用所致的星形胶质细胞和神经细胞的损伤。
　　方法
　　采用原代培养的小鼠大脑皮层星形胶质细胞，①分成三组:A对照组;B谷氨酸处理组(再分为谷氨酸浓度不同的亚组，分别加入谷氨酸0.1mM，0.3mM，1.0mM);C谷氨酸处理+ATP释放途径抑制剂组（再分为抑制不同ATP释放途径的几个亚组，分别加入VSOR氯离子通道抑制剂DCPIB10μM;大阴离子通道抑制剂氯化钆50μM;半通道抑制剂carbenoxolone100μM（同时亦作用于pannexins）;囊泡介导途径抑制剂BFA5μM和P2X7受体抑制剂考马斯亮兰G1μM)。于加入谷氨酸前，加入谷氨酸后3min，5min，15min，30min，1hr，2hr，4hr，6hr收集细胞外液检测ATP浓度。②分为A对照组;B谷氨酸处理组（谷氨酸终浓度为0.3mM）C谷氨酸处理+ATP释放途径抑制剂组氯化钆50μM，在特定的时间点0h、2h、6h、12h、24h吸取细胞外液进行LDH释放的测定，来观察细胞膜的完整性。③分为A对照组;B谷氨酸处理组（谷氨酸终浓度为0.3mM）;C谷氨酸处理+ATP释放途径抑制剂组氯化钆50μM组，在特定的时间点0h、2h、6h、12h、24h用Hoechst-PI双染色法检测形态学及细胞膜完整性。
　　实验数据以均数±标准差表示，SPSS17.0统计学软件分析数据。多组资料采用单因素方差分析(ANOVA)。P＜0.05表示差异有统计学意义。
　　结果
　　1、谷氨酸引起的星形胶质细胞ATP释放
　　培养成熟的星形胶质细胞细胞外液中基础量的ATP（5.941±0.740nM），当加入0.1mM，0.3mM，1.0mM谷氨酸后，3min时引起ATP释放的增加，大约在5min时达到顶点，细胞外液ATP浓度能达到基础量的1.5～2倍，与谷氨酸的浓度成正相关。之后ATP的浓度回落到基础值，但是在连续处理1hr时又会出现第二个小峰值。与对照组细胞相比，1.0mM谷氨酸组在3min、5min、15min、60min能促进ATP释放的增加，具有统计学差异;0.3mM组在3min、5min、15min具有统计学差异;0.1mM组在5min时有统计学差异。
　　2、谷氨酸诱导的ATP释放途径研究。
　　VSOR氯离子通道抑制剂DCPIB10μM、半通道抑制剂carbenoxolone100μM、囊泡介导途径抑制剂BFA5μM和P2X7受体抑制剂考马斯亮兰G（1μM）均不能阻滞谷氨酸引起的ATP释放，与谷氨酸处理组相比，没有统计学差异。
　　大阴离子通道抑制剂氯化钆50μM能够抑制谷氨酸引起的ATP释放，与谷氨酸处理组相比，在3min、5min、1hr这三个时间点能抑制谷氨酸引起ATP的释放，具有统计学差异。
　　3、谷氨酸引起的星形胶质细胞形态学及细胞膜完整性的检测。
　　①LDH释放:与对照组相比，6hr之内，谷氨酸处理组与抑制剂组差异没有显著性;但是12hr时谷氨酸处理组与抑制剂组LDH释放增加;24hr时与对照组相比差异具有统计学意义，抑制剂组的凋亡率低于单纯谷氨酸处理组。
　　②Hoechst-PI双染:在6hr之内，各组细胞状态没有明显改变，12hr之后谷氨酸组阳性细胞所占比例增加，24hr时损伤加重，加入抑制剂组损伤较谷氨酸组损伤轻。
　　1、大阴离子通道是谷氨酸诱导的星形胶质细胞释放ATP的重要途径。
　　2、通过抑制谷氨酸诱导的ATP的释放能够减少对星形胶质细胞的损害。

目录

声明

摘要

英文缩略语

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 星形胶质细胞ATP释放途径的研究进展

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