白毛莨碱通过抑制PAK4激酶活性阻遏人肺腺癌细胞增殖和侵袭

摘要

目的 肿瘤作为人类健康的主要杀手，其发生发展机制被广泛关注。研究表明，导致肿瘤早期发生和晚期侵袭转移的主要原因是肿瘤细胞信号转导通路的异常。2004年底Nature Reviews Cancer和Nature Reviews Drug Discovery联合论述了激酶信号通路在肿瘤中的作用，将激酶信号通路确定为肿瘤治疗的靶点，成为未来抗肿瘤药物的一项研发策略。 p21活化激酶(p21-activated kinase，PAK)，为一类进化上保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，目前被认为是肿瘤细胞内信号网络的关键调节因子。PAK作为小G蛋白Rho家族的下游靶蛋白，可被生长因子及其他胞外信号活化，并通过众多的下游结合蛋白或激酶底物，调节控制许多生物学功能，如:细胞凋亡、有丝分裂、细胞骨架重组等，特别是在细胞的恶性转化和肿瘤细胞侵袭转移过程中具有重要作用，因此被作为肿瘤治疗新的靶点。迄今为止PAK家族共发现6个成员，根据其结构及生化特性，大致将它们分为两类，Ⅰ类包括PAK1～3，Ⅱ类包括PAK4～6。PAK4是目前研究得最为深入的Ⅱ类PAK成员，在许多肿瘤细胞中存在过表达、基因扩增及突变等，可通过多条信号通路参与肿瘤的发生发展，被认为是肿瘤细胞信号网络的关键因子之一。目前国际上针对其为靶点的抑制剂研究处于起步阶段。 白毛莨碱(hydrastine)是由阿尔弗雷德·杜兰德发现的天然生物碱，存在于植物白毛茛（北美黄莲）的根状茎。白毛莨碱水解生成乙种北美黄连碱，Bayer在1910年将后者制成促凝血药。其代谢物的归属、生物利用度和药动学均得到了一定研究。有人对白毛莨提取物进行了抗肿瘤作用筛选，发现了其抗癌活性。白毛莨提取物对肿瘤来说是一把双刃剑。研究发现，大剂量白毛莨提取物有致瘤作用但是小剂量的白毛莨提取物具有抗肿瘤活性高、作用机制独特、毒副作用小等特点，但对于白毛莨碱尚未见到其抗肿瘤活性的报道。 本研究通过Kinase Glo激酶发光检测方法，发现了白毛莨碱((-)-β-hydrastine）对PAK4激酶的抑制作用。验证其对PAK4激酶活性的抑制作用，探究该化合物对肺癌细胞生物学功能的影响，为研究和开发新型抗肿瘤药物提供依据。 方法 一、白毛莨碱抑制肺癌细胞生长及其作用机制的研究 1、MTT实验检测白毛莨碱对细胞增殖的影响。 2、流式细胞术检测白毛莨碱对人肺癌细胞细胞周期的影响。 3、Western Blot方法检测白毛莨碱对Cyclin D1，Cyclin D3，CDK2，CDK4,CDK6，p18和p27这些细胞周期相关蛋白水平表达情况的影响。 二、白毛莨碱对PAK4激酶活性抑制作用的验证 1、用Kinase Glo激酶发光检测方法对白毛莨碱对PAK家族(PAK1，PAK4，PAK5，PAK6)激酶活性的影响进行分析。 2、激酶分析实验检测白毛莨碱在体外对PAK4激酶活性的影响。 3、用Kinase Glo激酶发光检测方法对白毛莨碱对PAK4激酶活性的影响进行分析。 4、Western Blot方法检测白毛莨碱对A549细胞PAK4激酶活性的抑制。 三、白毛莨碱通过影响PAK4激酶活性影响肺癌细胞增殖 1、MTT实验检测白毛莨碱是否通过抑制PAK4激酶活性抑制细胞增殖。 2、Western Blot方法检测白毛莨碱是否通过抑制PAK4激酶活性抑制CyclinD1等蛋白的表达。 四、白毛莨碱促进肺癌细胞早期凋亡及其作用机制的研究 1、ANNEXIN-Ⅴ-FITC试剂盒检测白毛莨碱对肺癌细胞凋亡水平的影响。 2、Hoechst33258染色检测白毛莨碱对A549细胞凋亡水平的影响。 3、Western Blot方法检测白毛莨碱对Caspase3，Caspase8，BAX和Bcl-2，PARP细胞凋亡相关蛋白的影响。 4、Western Blot方法检测白毛莨碱是否通过抑制PAK4激酶活性抑制Bcl-2等蛋白的表达。 5、JC-1染色检测白毛莨碱促进肺癌细胞凋亡是否通过线粒体途径。 五、白毛莨碱抑制肺癌细胞侵袭转移及其作用机制的研究 1、Transwell实验检测白毛莨碱对肺癌细胞迁移及侵袭能力的影响。 2、Western Blot检测白毛莨碱对Cofilinp-Ser3，LIMK1p-Thr508，SCG10p-Ser50和MMP2等细胞侵袭转移相关蛋白的影响。 3、Western Blot方法检测白毛莨碱是否通过抑制PAK4激酶活性抑制MMP2等蛋白的表达。 结果 一、白毛莨碱通过G1-S期阻滞抑制肺癌细胞增殖 1、白毛莨碱抑制人肺癌细胞A549，LTEP-A-2的增殖。 2、白毛莨碱抑制人肺癌细胞A549细胞周期中G1期向S期的转化。 3、在人肺癌细胞A549中，白毛莨碱在蛋白水平均能够下调细胞周期相关蛋白Cyclin D1，Cyclin D3，CDK2，CDK4，CDK6，p18和p27蛋白的表达。 二、白毛莨碱抑制PAK4激酶活性 1、白毛莨碱显著抑制PAK4激酶活性，对PAK家族中PAK1和PAK5激酶活性有微弱的抑制作用，对PAK6没有抑制作用。 2、白毛莨碱可抑制肺癌细胞内源PAK4激酶活性。 三、白毛莨碱通过抑制PAK4激酶活性抑制肺癌细胞增殖 1、MTT实验检测白毛莨碱通过抑制PAK4激酶活性抑制细胞增殖。 2、白毛莨碱通过抑制PAK4激酶活性抑制肺癌细胞CyclinD1等蛋白的表达。 四、白毛莨碱促进肺癌细胞早期凋亡及其作用机制的研究 1、白毛莨碱促进肺癌A549细胞的早期凋亡。 2、在A549细胞中，白毛莨碱能够促进PARP，Caspase3，Caspase8, BAX蛋白的表达以及降低Bcl-2蛋白的表达。 3、白毛莨碱通过抑制PAK4激酶活性促进肺癌细胞发生线粒体途径的凋亡。 五、白毛莨碱抑制肺癌细胞侵袭转移及其作用机制的研究 1、白毛莨碱能够抑制人肺癌细胞A549，LTEP-A-2的迁移及侵袭能力。 2、在A549细胞中，白毛莨碱能够抑制PAK4信号通路Cofilinp-Ser3，LIMK1p-Thr508，SCG10p-Ser50和MMP2的表达。 3、在A549细胞中，白毛莨碱通过抑制PAK4激酶活性抑制MMP2等蛋白的表达。 结论 1、白毛莨碱在体内体外均能够抑制PAK4的激酶活性。 2、白毛莨碱通过抑制PAK4激酶活性下调CyclinD1，CyclinD3，CDK2，CDK4，CDK6，p18和p27的表达，抑制肺癌细胞G1/S期的转化，从而抑制肺癌细胞增殖。 3、白毛莨碱也可通过抑制PAK4激酶活性促进肺癌细胞发生线粒体途径凋亡。 4、白毛莨碱通过抑制PAK4激酶活性下调Cofilinp-Ser3，LIMK1p-Thr508，SCG10p-Ser50和MMP2的表达，从而抑制肺癌细胞迁移及侵袭能力。

目录

声明

摘要

英文缩略语

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 白毛莨碱以及其生物学功能

在学期间科研成绩

致谢

个人简介