20--HETE经TGF--β/Smad信号通路调节小鼠肝肾Psmb5基因表达

摘要

目的 细胞色素P4504F2(cytochrome P4504F2，CYP4F2)编码一种ω-羟化酶，将花生四烯酸代谢生成二十羟基二十碳四烯酸(20-hydroxyeicosatetraenoic，20-HETE)，20-HETE作为第二信使和旁分泌因子，在心血管系统和肾脏中发挥重要的血压调节作用。一方面，20-HETE通过阻断Ca2+激活的钾通道收缩外周小动脉，并增强其他血管活性物质的缩血管效应而起促高血压作用;另一方面，20-HETE通过抑制肾脏近曲小管和髓袢升支粗段钠离子重吸收起抗高血压的作用。前期本课题组成功地构建了CYP4F2转基因小鼠模型，并证明了转基因小鼠肝脏和肾脏CYP4F2蛋白高表达，20-HETE合成增加，呈高血压表型。利用转基因手段使20-HETE获得性升高的CYP4F2转基因小鼠，为深入研究20-HETE的生理作用机制提供了有力支撑。 细胞内的蛋白质时刻处于生产、行使功能和降解的动态平衡，为了维持这一平衡，泛素-蛋白酶体系统发挥重要的作用。该系统负责真核细胞内非溶酶体途径的蛋白降解，参与细胞周期调控、细胞生长和凋亡等过程。蛋白酶体β5亚单位(proteasomo subunitβ5，PSMB5)具有糜蛋白酶活性，是泛素-蛋白酶体系统的关键酶。因此，一旦PSMB5发生改变将导致异常蛋白累积或正常蛋白过度降解，这些都有可能导致疾病的发生。前期我们在对CYP4F2转基因小鼠的研究中发现，转基因小鼠与野生型小鼠相比，蛋白酶体活性存在明显差异，同时芯片筛查结果显示Psmb5基因在转基因和野生型小鼠中的表达存在差异。因此本研究凭借CYP4F2转基因小鼠这一研究平台，以肝脏和肾脏为靶器官，辅助细胞模型，深入探讨20-HETE对小鼠Psmb5基因表达的调节作用及具体机制。 材料与方法 一、实验材料 1、CYP4F2转基因小鼠(FVB/N小鼠)。 2、小鼠肝细胞系(NCTC1469)、小鼠肾细胞系(M1)。 3、刺激药物:高纯度20-HETE、 SB431542、HET0016。 4、RNA提取相关试剂、RT试剂盒及Real-time PCR相关试剂。 5、Western blot相关试剂。 6、质谱检测用TGF-β1肽段、20-HETE标准品:20-HETE-d6。 7、免疫组化相关试剂及试剂盒。 8、基因重组及萤光素酶报告基因检测相关试剂及试剂盒。 9、电泳泳动迁移实验(EMSA)相关试剂及试剂盒。 二、实验方法 1、Western blot方法检测转基因和野生型小鼠肝、肾CYP4F2蛋白表达;免疫组化方法定位CYP4F2蛋白在肝、肾的组织分布;应用液质联用仪(LC-MS)检测肝、肾20-HETE水平。 2、Western blot方法检测转基因和野生型小鼠肝、肾PSMB5蛋白表达;应用HET0016阻断20-HETE的合成，检测PSMB5蛋白表达;采用Real-time PCR方法检测Psmb5的mRNA表达水平。 3、利用生物信息学软件分析小鼠Psmb5基因启动子区结构，构建Psmb5启动子-127～-1区野生及突变型萤光素酶报告基因重组体，应用双荧光素酶活性检测系统检测启动子的活性以及20-HETE对Psmb5启动子活性的影响;EMSA实验鉴定Psmb5启动子区内Smad binding element(SBE)。 4、应用液质联用仪(LC-MS)检测转基因和野生型小鼠肝、肾TGF-β1水平;Western blot方法检测转基因和野生型小鼠肝、肾Smad3蛋白的磷酸化水平。 5、培养小鼠肝细胞(NCTC1469)和肾细胞(M1)，给予不同浓度(0.1、0.5、1、2μ M)的20-HETE刺激2小时，检测Psmb5的蛋白表达水平;应用SB431542抑制TGF-β/Smad信号通路，给予20-HETE刺激，检测Psmb5的蛋白表达。 结果 1、CYP4F2转基因小鼠肝、肾组织中CYP4F2蛋白过表达，且肝脏中CYP4F2蛋白丰度高于肾脏，过表达的CYP4F2蛋白主要分布在部分肝小叶和肾脏的近端小管。用LC-MS检测小鼠肝、肾组织中20-HETE的水平，发现与野生型小鼠相比，转基因小鼠肝中20-HETE增加了104％，肾中增加了67％。 2、Western blot检测结果显示，与野生型小鼠相比，转基因小鼠肝中PSMB5蛋白丰度上调了54％，肾中PSMB5蛋白丰度下调了50％;应用20-HETE合成抑制剂HET0016处理后，PSMB5蛋白在转基因与野生型小鼠肝、肾中表达的差异均消失，说明是转基因小鼠体内高水平的20-HETE影响了Psmb5基因的表达，并且其在肝、肾中对PSMB5发挥不同的调节作用。另外，应用Real-timePCR检测小鼠Psmb5基因的mRNA水平，发现其mRNA水平的变化趋势与蛋白水平一致，提示20-HETE是在转录水平调节小鼠Psmb5基因的表达。 3、应用ALiBaba2.1和softberry等生物信息学软件分析小鼠Psmb5基因启动子区域，发现在-74～-67存在典型的Smad结合位点，Smad binding element(SBE)5，-GTCTAGAC-3，;应用萤光素酶检测系统检测发现20-HETE可显著上调肝细胞中小鼠Psmb5基因的转录活性，下调肾细胞中小鼠Psmb5基因的转录活性，而对突变了SBE的Psmb5萤光素酶报告基因无影响;EMSA实验证实了软件预测结果，即在小鼠Psmb5基因启动子区存在SBE反应元件。 4、Western blot检测结果表明与野生型小鼠相比，转基因小鼠肝脏TGF-β1表达上调(1.98 vs.2.69ng/ug protein)，Smad3蛋白的磷酸化水平增强;肾脏TGF-β1表达下调(3.23 vs.2.05ng/ug protein)，肾脏Smad3蛋白的磷酸化水平减弱。以上结果说明20-HETE可激活肝脏TGF-β/Smad信号通路，抑制肾脏TGF-β/Smad信号通路。 5、在体外实验中，应用20-HETE合并TGF-β/Smad信号通路抑制剂SB431542处理细胞验证上述结果，证实了20-HETE可以通过TGF-β/Smad信号通路上调肝细胞中PSMB5蛋白的表达（1μM上调80％），而在M1细胞中没有观察到明显的改变。 结论 20-HETE通过激活肝脏TGF-β/Smad信号通路上调肝脏Psmb5基因的表达，抑制肾脏TGF-β/Smad信号通路下调肾脏Psmb5基因的表达。

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实验结果

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参考文献

综述 20-HETE与TGF-β的相互作用研究

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