比较蛋白质组学技术在差异表达蛋白检测中的应用研究

摘要

研究背景及目的：
　　近年来，蛋白质组学(proteomics)研究已广泛应用于生命科学领域，它以基因编码的所有蛋白质组为研究对象，在整体水平上分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平及修饰状态、以及蛋白质之间的相互作用与联系，从而揭示蛋白质功能及其与细胞生命活动规律的关系。而比较蛋白质组学(comparativeproteomics)主要是研究病理状态下细胞的蛋白质表达水平与正常生理条件下的差异，或者分析比较机体在不同时刻或状态下蛋白质的差异和变化规律，从而为探索细胞分子机制及寻找治疗药物靶点提供科学依据。
　　比较蛋白质组学的核心技术是以双向凝胶电泳（two-dimensionalpolyacrylamide gel electrophoresis，2-DE）为主的蛋白质分离技术和以基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flightmass spectr(e)metry, MALDI TOF MS)、生物信息学(bioinformatics)为主的蛋白质鉴定技术。其中蛋白分离技术尤以双向荧光差异凝胶电泳(two dimensionalfluorescent difference gel electrophoresis，2D-DIGE)更具优越性，该技术使用荧光染料标记样本，对电泳分离的蛋白进行定量分析，使检测具有更高的敏感性和准确性。这些技术具备高通量、高灵敏度、高分辨率、可重复性强、高度自动化等优势，非常适合对蛋白质进行大规模的平行分离和分析，配合相应分析软件和数据库，可以在短时间内处理大量的数据。生物信息学的发展丰富了蛋白质组学的技术平台，便于更深层次挖掘蛋白质生物学功能与特性，例如揭示蛋白质之间的相互作用，以及建立蛋白质相互作用关系的网络图。
　　综上所述，比较蛋白质组学研究能够对疾病的发生过程中的蛋白调控网络有着广泛而完整的认识，从而进一步寻找疾病发生的标志性蛋白，或新的药物作用靶点:
　　本研究第一部分是应用比较蛋白质组学技术鉴定产后小鼠胸腺发育成熟相关的差异表达蛋白。胸腺是机体重要的中枢免疫器官，是自身免疫耐受的中心并参与机体免疫调节，为淋巴细胞的分化、发育和成熟提供了重要的场所。许多证据表明胸腺发育受其微环境中的众多信号转导因子调控，它们对淋巴细胞的正常发育至关重要。新生儿免疫系统发育不成熟，胸腺微环境失调可引起胸腺功能紊乱，因此更容易发生免疫缺陷或免疫损伤。
　　本研究第二部分是应用比较蛋白质组学技术研究姜黄素（curcumin）作用胃癌细胞的差异表达蛋白，探讨药物的肿瘤抑制机制。天然抗肿瘤药姜黄素具有强有力的肿瘤抑制作用，目前已知姜黄素肿瘤抑制机制包括抑制突变的形成，抑制癌基因的表达，以及调控细胞的周期、凋亡与转移等，它在胃癌细胞中的作用机制仍未弄清。应用比较蛋白质组学技术检测姜黄素干预胃癌细胞的差异蛋白表达谱，探讨药物的抗肿瘤机制，所鉴定出的差异表达蛋白可能成为潜在的分子靶点，为抗癌药的研发提供实验依据。
　　实验方法：
　　一、鼠胸腺蛋白提取与2D-DIGE分析
　　BALB/c雌鼠待产，取自中国医科大学实验动物部。待小鼠出生，终止饲养，摘取母鼠（8周龄）和胎鼠（出生1天）胸腺组织，将组织破碎裂解、提取总蛋白，去除核酸及杂质后进行蛋白定量。将提前制备的CyDye荧光染料调整其终浓度至400 pmol/μl，取1μl CyDye工作液标记50μg蛋白样品，-80℃避光保存。将Cy2、Cy3、Cy5三种荧光标记的蛋白样品混匀加入适量水化液使总体积450μl，先后进行等电聚焦和SDS-PAGE分离，采集荧光图像并分析。
　　二、细胞培养、药物干预与凋亡分析
　　用含10％胎牛血清的DMEM培养液培养胃癌细胞BGC-823，置于37℃、5％ CO2培养箱中。以不同浓度的姜黄素（0、10和30μM）对BGC-823胃癌细胞分别作用24 h和48 h后，用凋亡试剂盒AnnexinⅤ-FITC中的FITC AnnexinⅤ和PI对细胞进行染色，流式细胞技术分析。
　　三、细胞总蛋白提取与2-DE分析
　　实验组细胞用30μM姜黄素处理，对照组细胞用等体积的DMSO处理，作用时间均为24 h。提取实验组和对照组细胞总蛋白，去除核酸及杂质、蛋白定量，把各组蛋白800μg加入电泳上样液中进行等电聚焦和SDS-PAGE分离。将电泳后凝胶进行考马斯亮蓝染色，脱色至背景清晰后进行图像采集与分析。
　　四、MALD-TOF/TOF质谱鉴定
　　利用自动挖点仪对凝胶进行挖点，将获得的胶粒进行胶内酶解及点靶。将样品板置于质谱检测器分析，采用线性模式，一级质谱获得肽质量指纹图（Peptidemass fingerprinting, PMF），精确度采用100ppm;二级质谱获取PMF后再选取2～3个一级峰进行二级质谱模式下的碎片化分析，精确度采用50 ppm。将获得的一级图谱(MS)和二级谱图(MS/MS)通过flexAnalysis3.0软件中的BioTools3.0工具进行分析。
　　五、生物信息学分析
　　所获得的蛋白序列用MASCOT搜索软件（http://www.matricscience.com）在Swiss-Prot数据库中进行比对分析，利用Swiss-Prot和NCBI数据库网络检索蛋白功能和序列信息。
　　六、蛋白质间相互作用分析
　　差异表达蛋白之间的相互作用通过在线数据库STRING9.1（http://string-db.org）分析，获得蛋白质相互作用网络图。
　　七、Western blot验证蛋白质表达
　　提取样品总蛋白并定量后进行垂直SDS-PAGE电泳，用转移槽转印蛋白至PVDF膜上，用抗体偶联进行免疫印记检测，最后用ECL发光底物显影。
　　实验结果：
　　一、姜黄素对胃癌细胞凋亡作用的分析
　　流式细胞技术分析发现姜黄素干预后的BGC-823凋亡细胞比例增高，两种浓度的姜黄素作用细胞24 h后凋亡细胞数比对照组凋亡细胞数分别增加了8.51％和32.3％，作用细胞48 h后凋亡细胞数分别增加了25.5％和41.3％。
　　二、双向电泳技术分离差异表达蛋白
　　应用2D-DIGE技术成功建立新生小鼠和成年小鼠胸腺组织的差异蛋白表达谱:每块凝胶平均可检测到2274个蛋白点，两组蛋白匹配的蛋白点约1406个;大部分蛋白的等电点位于pH4～8、分子量在20～100 kDa;在新生小鼠胸腺组中共检测到317个蛋白表达水平升高，194个蛋白表达水平降低。
　　应用2-DE技术成功建立姜黄素干预胃癌细胞前后的差异蛋白表达谱:每板胶检测的蛋白点平均约1200个，各凝胶之间经分析软件匹配上的蛋白点占单块凝胶蛋白点的70％;蛋白表达差异超过1.5倍的共有75个，其中姜黄素组中有33个蛋白表达上调、42个蛋白表达下调。
　　三、质谱鉴定差异表达蛋白
　　在小鼠胸腺组织的差异表达蛋白中，采用MALDI-TOF MS一级质谱成功鉴定出的蛋白点共111个，包括细胞骨架蛋白Beta-actin、Actinin-4、Septin-7、Cofilin-1、Coactosin-like protein和Stomatin-like protein2，热休克蛋白家族成员60 kDa heatshock protein、Heat shock protein75 kDa、Stress-70 protein和Nucleophosmin，胞外基质糖蛋白Tenascin，以及蛋白酶体蛋白Proteasome activator complex subunit1等。
　　在姜黄素干预胃癌细胞前后的差异表达蛋白中，采用MALDI-TOF/TOF MS二级质谱成功鉴定出的蛋白点共52个，包括凋亡相关蛋白Translationally-controlled tumor protein、Heat shock70 kDa protein14、T-complexprotein1、Apoptosis-inducing factor1和Annexin A1，翻译起始相关蛋白Eukaryoticinitiation factor4A和2A，代谢相关蛋白Delta(3，5)-Delta(2，4)-dienoyl-CoA isomerase和L-lactate dehydrogenase B chain等。
　　四、差异表达蛋白的生物学功能与亚细胞定位分析
　　通过Swiss-Prot和NCBI生物信息学数据库检索蛋白的功能和定位信息，两实验鉴定出的差异表达蛋白在生物学功能上主要包括细胞增殖、周期与凋亡、转录调控、信号转导、核酸处理与加工、蛋白质水解与翻译、蛋白质折叠、物质代谢、氧化还原、细胞骨架与运动、免疫应答、以及胚胎发育等;在亚细胞定位上主要包括细胞膜、内质网、线粒体、细胞核、细胞浆、细胞外基质与分泌、过氧化物酶体、以及其它部位等。
　　五、差异表达蛋白之间相互作用分析
　　在线工具STRING9.1整合了差异表达蛋白间可能发生的物理性相互作用和功能性相互作用，利用该分析工具我们得到了差异表达蛋白之间的相互作用网络，本次实验获得的蛋白质相互作用网络主要与维持细胞功能和结构、细胞组装和重组、以及细胞代谢等方面密切相关。
　　六、差异表达蛋白的Western blot验证
　　为了证实前期分离鉴定得到的蛋白表达情况，我们选择4个蛋白(Actinin-4、60 kDa heat shock protein、 Beta-actin和Cofilin-1)进行Western blot验证，结果显示Actinin-4、60 kDa heat shock protein和Beta-actin在新生小鼠胸腺中表达增高，而Cofilin-1在成年小鼠胸腺中表达增高，该结果与二维凝胶电泳检测的结果吻合。
　　结论：
　　1、本研究成功建立基于双向电泳和质谱的蛋白质组学技术平台，获得新生小鼠和成年小鼠胸腺组织的差异蛋白表达谱，以及姜黄素抑制胃癌细胞的差异蛋白表达谱。
　　2、成功鉴定出与产后小鼠胸腺发育成熟密切相关的蛋白;鉴定出姜黄素影响胃癌细胞生长与凋亡切相关的蛋白。
　　3、绘制差异表达蛋白之间的相互作用网络，为阐明差异表达蛋白在其中的作用机制打下良好的实验基础。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 应用比较蛋白质组学(2D-DIGE)技术鉴定新生小鼠与成年小鼠胸腺组织中的差异表达蛋白

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

论文二 姜黄素干预胃癌细胞系BGC-823的蛋白质组学研究

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 蛋白质组学技术在研究系统性红斑狼疮发病机制与诊断标志物方面的应用

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