妊娠早期母体来临床甲减影响后代海马IGF-1通路相关蛋白的表达

摘要

前言
　　甲状腺激素对于调节中枢神经系统的发育起着重要的作用[1]，如果母体在胎儿甲状腺功能尚未完全建立起来时分泌不足，会不同程度的影响后代神经系统的发育。已有很多关于母体妊娠期临床甲减影响后代智力发育的报道，但妊娠期亚临床甲减对后代脑发育影响的报道相对较少。本课题组以往的研究已经成功建立了亚临床甲减的动物模型，用以探讨妊娠期亚临床甲减影响后代脑发育的机制，但是其详尽机制还不清楚。IGF-1介导的PI3K-Akt通路对于神经系统的发育有重要生物学作用，同时也与神经兴奋突触后电位LTP密切相关。因此本研究采用亚临床甲减的动物模型，观察妊娠期亚临床甲减对后代海马组织中IGF-1、IGF-1R和p-Akt水平的影响。
　　方法
　　60只SPF级雌性Wistar大鼠随机分成3组（每组n=20）。①正常对照组:行假甲状腺切除术，术后30天每日开始皮下注射等量生理盐水，作为正常对照组(CON);②临床甲减组:手术切除甲状腺，术后30天眶后静脉丛取血验TSH和TT4，当TSH高于正常组、TT4＜1.0μg/dL(检测范围最小值)时，临床甲减大鼠(CH)模型建立成功。③亚临床甲减组:临床甲减大鼠(CH)模型建立成功的基础上，开始每日皮下注射左甲状腺素(L-T4)，以1.0μg/(100g·d)浓度持续注射，当血清TSH高于正常、但TT4水平在正常范围时，提示亚临床甲减大鼠(SCH)建模成功。各组模型建立成功后，雌鼠与正常的雄鼠合笼交配，雌鼠镜下阴道涂片发现精子确定为妊娠0天，记为E0。L-T4及生理盐水持续皮下注射至仔鼠生后20天，将分娩当日定为P0天。母鼠于E0及P1时眶后静脉丛取血，测定血清TSH、TT4，确定模型在整个孕期均是成功的。各组仔鼠分别在出生后第3天(P3)以及第7天(P7)冰上断头，取海马组织，以RT-PCR方法检测IGF-1mRNA的表达，以ELISA方法检测IGF-1、IGF-1R蛋白水平的表达，以Western-blot方法检测Akt和p-Akt蛋白水平的表达。仔鼠出生后第40天(P40)行Morris水迷宫行为学检测及海马兴奋性突触后电位LTP检测。应用SPSS16.0软件对各组实验数据进行分析和处理。
　　结果
　　一、亚临床甲减孕鼠模型制备情况
　　在妊娠0天(E0)和仔鼠出生后1天(P1)，亚临床甲减组(SCH)母鼠血清TSH水平明显高于同期正常对照组(p=0.000)，而血清TT4与正常对照组无统计学差异;提示亚临床甲减孕鼠模型制备成功，且在孕期一直处于亚临床甲减状态。
　　二、母体亚临床甲减导致后代海马IGF-1介导的通路相关蛋白水平表达降低
　　P3时亚临床甲减组仔鼠海马的IGF-1、IGF-1R和p-Akt蛋白的表达均低于正常对照组(P＜0.05)，而显著高于临床甲减组(P＜0.05);P7时亚临床甲减组仔鼠IGF-1、IGF-1R及p-Akt的表达仍低于正常对照组仔鼠(P＜0.05)，而IGF-1R和p-Akt的表达虽高于临床甲减组仔鼠，但无统计学差异(P＞0.05)。
　　三、母体亚临床甲减的后代空间学习和记忆能力受损
　　Morris水迷宫行为测定结果:定位航行试验中，随着训练次数的增加，各组的逃避潜伏期总的趋势是不断缩短，第5天训练结束撤掉平台后，对照组逃避潜伏期为（15.06±6.48）s，亚临床甲减组为（27.88±7.98）s，临床甲减组为(49.21±9.87)s，三组间两两比较，逃避潜伏期均有显著性差异(p＜0.05)。临床甲减组始终长于对照组。亚临床甲减组潜伏期在第1、2天与正常对照组无明显差异(p＞0.05)，第3、4天逃避潜伏期长于正常对照组，有统计学差异(p=0.034;p=0.047)。最后一天撤掉平台后，亚临床甲减组穿越平台象限次数为（10.8±3.51）次，正常对照组穿越平台次数为（13.5±4.08）次，临床甲减组穿越平台象限次数为（8.3±4.28）次，三组间两两比较均有统计学差异(p＜0.05)。
　　四、母体亚临床甲减导致后代的兴奋性突触后电位LTP减弱
　　海马经强直刺激后各组兴奋性突触后电位的斜率均增加。亚临床甲减组和临床甲减组均低于正常组（均p=0.000）。亚临床甲减组仔鼠电位斜率增加百分比低于正常组(p=0.000)，但是高于临床甲减组(p=0.002)。
　　结论
　　1、妊娠期亚临床甲减能够导致后代空间学习和记忆能力的损害;亚临床甲减的损害程度低于临床甲减。
　　2、母体亚临床甲减损害仔鼠空间学习和记忆能力可能与仔鼠海马与LTP相关蛋白IGF-1、p-Akt蛋白的含量，减弱LTP的产生有关。

目录

声明

摘要

英文缩略语

前言

材料与方法

一、实验动物

二、主要仪器设备

三、主要试剂

四、实验试剂的配制

五、实验模型的建立

六、母鼠血清TSH、TT4的检测

七、标本的采集及制备

八、实验方法

结果

一、母鼠TSH、TT4水平测定

二、各组仔鼠海马IGF-1mRNA的表达变化

三、各组仔鼠海马IGF-1和IGF-1R蛋白含量变化

四、各组仔鼠海马Akt和P-Akt蛋白含量变化

五、各组仔鼠Morris水迷宫

六、各组仔鼠兴奋性突触后电位LTP的比较

讨论

结论

参考文献

本研究的创新性和自我评价

综述 妊娠亚临床甲减与后代脑发育

致谢

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