脑缺血/再灌注期MAPK/ERK信号通路与PI3K/AKT信号通路的相互作用

摘要

目的：
　　有丝分裂活化蛋白激酶(MAPK)/细胞外调节蛋白激酶(ERK)分子信号通路是表皮生长因子受体(EGFR)下游的主要分子信号通路之一，其激活过程如下：细胞膜表面的EGFR直接或间接激活，激活的EGFR通过一定途径将胞质中的生长因子受体绑定蛋白(Grb)2，Src同源和胶原蛋白(Shc)，SOS1(Sonof Sevenless)蛋白，激活下游的小G蛋白Ras磷酸化激活下游的Raf, Raf进一步激活MEK，最后激活ERK。
　　PI3K/AKT信号通路是EGFR下游的另一条重要的信号分子通路，EGFR磷酸化激活后招募shc，Grb2，SOS1至细胞膜，形成Shc-Grb2-SOS1复合物，复合物可招募并激活小G蛋白Ras，Ras可激活p110 PI3K从而激活PI3K。激活的PI3K可将3，4，或4，5-二磷脂酰肌醇(PIP2)催化成为3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)，PIP3可以招募并激活PDK1， PDK1可进一步磷酸化Akt的T308及S473，从而激活Akt。
　　众多研究发现EGFR间接激活，MAPK/ERK信号通路，PI3K/AKT信号通路在缺血/再灌注时过程中具有作用。如心肌细胞缺血预处理通过EGFR间接激活发挥心肌保护作用。EGFR间接激活还在再灌注引起的心率失常中发挥作用。以新生的小猪为研究对象，大脑皮层在低氧情况下可以导致NO依赖性的EGFR磷酸化和激活增加。以大鼠大脑中动脉模型为研究对象，结果显示在短暂性缺血1hr后皮质边缘区的EGFR磷酸化在再灌注3，7，14天均有显著性提高。有研究发现在MCAO模型中使用EGFR抑制剂C225可明显减少缺血灶范围，减少反应性星型胶质细胞增生。研究发现PI3K/AKT信号通路主要发挥细胞保护的作用，然而MAPK/ERK信号通路的作用更为复杂。研究发现短暂的，不剧烈的ERK磷酸化升高具有细胞保护作用，如缺血预处理中ERK磷酸化的改变及其发挥的作用。与之相反，持续性的ERK磷酸化可以导致细胞损伤。
　　EGFR是受体酪氨酸激酶（RTKs）家族中的一员，其结构主要由三部分构成，细胞外的配体结合区域，单跨膜区域，胞内酪氨酸激酶区域。当EGF家族成员与EGFR结合后，EGFR形成同源或异源二聚体，EGFR二聚体的胞内酪氨酸激酶区域特定位点具有自身固有的酪氨酸激酶活性，从而使得EGFR发生自身磷酸化。EGFR的胞内酪氨酸激酶区域中存在多个磷酸化位点，EGFR上的这些磷酸化位点与作为连接位点与多种蛋白结合，由于磷酸化位点的结构差异，磷酸化位点与蛋白的亲和力也有所差别，从而导致磷酸化位点与特定的蛋白结合，激活和调节下游特定的分子信号通路。不同刺激可导致EGFR上不同位点磷酸化水平改变，从而导致下游信号通路活化水平的改变。
　　Raf-1由3个保守区域(CR)构成。其中CR1为结合区，包含1个Ras结合区域（RBD）和1个半胱氨酸富集区域(CRD)，RBD与Ras及细胞膜的磷脂结合，使得Raf-1可以被招募到细胞膜上，Ras与Raf-1的CR2是参与负性调节Raf-1活性及Ras-Raf-1结合的磷酸化位点，CR3是功能区，区域中氨基酸位点的激活使得Raf-1具有蛋白激酶活性。研究对Raf-1活性调节的具体机制进行研究，结果发现Raf-1的338位丝氨酸和341位酪氨酸磷酸化是Raf-1激活所必须的，其中Ser338由Ras或生长因子激活。Raf-1的激活也能通过Raf-1上其他氨基酸位点的磷酸化进行负性调节。Ser259是抑制Raf-1活性的主要位点，AKT通过磷酸化Raf-1的Ser259来抑制Raf-1活性。
　　MAPK/ERK信号通路与PI3K/AKT信号通路是EGFR之后的重要的下游信号通路，早期研究认为这两条通路相互独立，之后越来越多的研究发现在多种条件下这两条通路之间存在相互作用(Crosstalk)，而这些Crosstalk在调节这两条通路的激活上发挥重要作用。目前研究发现MAPK/ERK信号通路对PI3K/AKT信号通路的影响有正性影响和负性影响，
　　PI3K/AKT信号通路主要通过影响Ras，Raf-1来影响MAPK/ERK信号通路。PI3K/Akt通路对Ras/ERK通路的调节机制之一为PIP3对RasGEF及RasGAP的调节，活化的AKT直接磷酸化Raf的负性调节位点Ser259来降低Raf活性。此外，PI3K可激活Rac/Cdc42/PAK通路，PAK可磷酸化Raf的正性功能调节位点Ser338来上调Raf活性，从而提高下游的ERK磷酸化。
　　方法：
　　采用大鼠大脑中动脉模型。①在MCAO模型缺血前分别侧脑室注射选择性PI3K抑制剂LY294002，AKT抑制剂Triciribine，EGFR抑制剂AG1478，MMP抑制剂GM6001，MEK抑制剂U0126，用免疫印迹方法检测脑组织EGFR，ERK，AKT磷酸化水平，EGFR酪氨酸位点磷酸化情况，Raf的Ser259及Ser338磷酸化情况，用免疫共沉淀方法检测SOS1与EGFR的连接情况，Raf-1与pAKT的连接情况;②在MCAO模型再灌注前侧脑室注射EGFR抑制剂AG1478，MMP抑制剂GM6001，MEK抑制剂U0126，ROS抑制剂Catalase，用免疫印迹方法检测脑组织EGFR，ERK，AKT磷酸化水平，EGFR酪氨酸位点磷酸化情况。
　　使用SPSS12.0软件进行统计学分析，多组资料用one-way ANOVA方法进行比较，P＜0.05表示差异具有统计学意义。
　　结果：
　　1.脑缺血期脑内ERK1/2，AKT, EGFR的激活
　　检测大鼠脑缺血后2小时，脑组织ERK1/2，AKT的磷酸化情况。结果显示，缺血时ERK1/2磷酸化水平无明显改变，AKT磷酸化水平明显升高。在脑缺血前侧脑室注射抑制剂AG1478，GM6001，其中AG1478是EGFR的抑制剂，GM6001是锌离子依赖性金属蛋白酶的抑制剂可明显降低AKT磷酸化水平。
　　缺血时EGFR的Y845，Y1173，Y1045磷酸化明显升高，其中Y845磷酸化水平增加程度最大，是Contralateral hemisphere的400％。结果显示Ischaemia及Contralateral hemisphere的Y992，Y1068均无磷酸化。
　　2.脑缺血期SOS1及Raf-1的功能
　　缺血时SOS1与EGFR的结合程度明显升高。缺血时Raf-1 Ser259磷酸化明显升高，Raf-1 Ser338磷酸化无改变。
　　3.脑缺血期PI3K/AKT信号通路对Raf-1的影响
　　缺血时Raf-1与p-AKT的结合程度明显升高。缺血前侧脑室分别注射PI3K抑制剂LY294002，AKT抑制剂TCN，可明显降低缺血时的AKT磷酸化程度。
　　讨论：
　　首先，本研究发现缺血期ERK1/2磷酸化与非缺血期相比无明显改变，而再灌注期ERK1/2磷酸化明显升高。缺血期AKT磷酸化明显升高，而且这种AKT磷酸化的升高可以被EGFR抑制剂AG1478及金属蛋白酶GM6001所抑制，说明缺血期AKT磷酸化的升高与EGFR间接激活相关，而不是EGFR的直接激活。缺血期EGFR磷酸化明显升高，使用EGFR磷酸化位点抗体对EGFR磷酸化位点进行研究，结果显示缺血期EGFR的磷酸化位点是Y1173，Y845，Y1045。Y992，Y1173，Y1045是主要的自身磷酸化位点，其中以Y1173磷酸化为主，Y992磷酸化最低。Y845则是主要的Src磷酸化位点。EGFR磷酸化位点的磷酸化情况与细胞种类相关，有研究显示脑中和星型胶质细胞的EGFR的Y1068并不发生磷酸化，除非使用EGF和氨刺激。
　　其次，本研究发现虽然缺血期ERK1/2无明显磷酸化，但在EGFR/Ras/Raf/MEK/ERK通路中SOS1与Ras的相互作用与非缺血期相同。缺血期Raf-1的活化磷酸化位点Ser338的磷酸化与非缺血期无明显差异，而缺血期Raf-1的活性抑制磷酸化位点Ser259的磷酸化升高。这一结果说明缺血期ERK1/2无明显磷酸化是因为EGFR/Ras/Raf/MEK/ERK通路中的Raf-1的活性受抑制。缺血期的Raf-1与p-AKT的链接增强。为了验证缺血期PI3K/AKT通路对Raf/MAPK/ERK通路的抑制作用，我们在缺血期前侧脑室注射PI3K抑制剂 LY294002及AKT抑制剂TCN，结果显示LY294002和TCN均能升高缺血期ERK1/2的磷酸化水平。提示缺血期PI3K/AKT信号通路抑制Raf/MAPK/ERK1/2信号通路。
　　结论：
　　脑缺血/再灌注期Raf/MAPK/ERK1/2信号通路和PI3K/AKT信号通路之间存在抑制性相互作用。脑缺血期PI3K/AKT信号通路通过磷酸Raf-1的抑制性位点Ser259来抑制Raf/MAPK/ERK1/2信号通路;再灌注期ROS通过刺激PTEN来抑制PI3K/AKT信号通路，从而降低其对Raf/MAPK/ERK1/2信号通路的抑制作用。本研究结果为理解脑缺血/再灌注期的病生改变及新的治疗方案提供参考依据。

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结论

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综述 MAPK／ERK信号通路与PI3K／AKT信号通路之间相互作用相关研究

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