鞘内移植NGF诱导培养MSCs对兔脊髓缺血再灌注损伤影响的研究

摘要

目的：
　　脊髓缺血再灌注损伤是临床上主动脉瘤、大血管畸形和心脏等大手术的严重并发症，容易导致感觉和运动缺失以及膀胱、肠道和性功能等不可逆的生理功能障碍。脊髓缺血再灌注损伤机制主要是缺血再灌注后神经元凋亡、慢性脱髓鞘改变（Wallerian变性）、大量自由基参与脂质过氧化以及离子钙超负荷等引起微血管痉挛和闭塞加重微循环障碍。大多研究者认为干细胞移植可替代和补充丢失的神经细胞，细胞分泌各种神经营养因子促进髓鞘的再生，桥接神经缺损后遗留的物理空隙，为轴突的生长提供物理支架，改善轴突再生的微环境，从而减轻脊髓缺血再灌注损伤。用于移植治疗的细胞主要是骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stemcells，MSCs)。MSCs具有很多独特的优越性，能在中枢神经系统内存活、迁移，表达神经元特异性核蛋白(neuronal nuclear antigen，NeuN)或星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白(gliat fibrillary acidicprotein，GFAP)，脱髓鞘变的轴突再髓鞘化，明显减轻脊髓缺血再灌注损伤导致的神经功能障碍。关于MSCs移植保护脊髓损伤机制的研究重点在MSCs分化、分泌脑源性神经营养因子(brain-derivedneurotrophic factor，BDNF)和神经生长因子(nerve growth factor，NGF)等神经营养因子、抗凋亡、促进髓鞘再生、促进局部新生血管生成和血管重建等方面。提高MSCs在受损脊髓的存活、分化和分泌功能是研究MSCs移植治疗脊髓缺血再灌注损伤关键之一。以往研究表明，NGF具有神经元营养和促轴突生长双重生物学功能;也具有促进血管新生的作用，有直接促进内皮细胞血管新生的作用。
　　本研究利用NGF诱导培养MSCs，研究MSCs在体外的分化、增殖和分泌功能;用绿色荧光蛋白重组腺病毒(Ad-GFP)转染NGF诱导培养MSCs后鞘内移植，再制作兔脊髓缺血再灌注损伤模型，采用Tarlov神经功能评分法和下肢SEP检测脊髓缺血再灌注损伤的神经功能修复，然后以GFP荧光直接观察NGF诱导培养MSCs在缺血再灌注损伤脊髓迁移、存活;运用免疫荧光技术和western-blot技术检测NGF诱导培养MSCs在缺血再灌注损伤脊髓的分化和分泌功能;从而探索一种具有临床应用价值的脊髓缺血再灌注损伤保护方法，并初步探讨相关机制。
　　方法：
　　第一部分:NGF诱导培养MSCs在体外生长、分化、增殖和分泌的实验研究
　　日本大耳白兔麻醉后胫骨穿刺提取骨髓，然后分离获取MSCs，根据培养基中是否加入NGF，分MSCs和NGF-MSCs两组细胞培养传代;用流式细胞仪检测两组培养细胞的表面标志物CD34、CD45、CD90表达率进行细胞鉴定;在显微镜下观察计数并绘制两种细胞生长曲线图比较MSCs和NGF-MSCs的生长;采用细胞免疫荧光染色观察比较MSCs和NGF-MSCs在体外分化方向和增殖功能;运用Real-time PCR和ELISA方法检测比较两种细胞分泌BDNF、NGF、VEGF和HGF的功能。
　　第二部分:NGF诱导培养MSCs鞘内移植对兔脊髓缺血再灌注损伤影响的研究
　　运用Ad-GFP转染MSCs或NGF-MSCs，在荧光显微镜下观察转染后细胞的生长和转染成功率，采用流式细胞仪鉴定后鞘内移植，2天后再制作兔脊髓缺血再灌注损伤模型;实验分为5组，每组24只日本大耳白兔，共120只。con组:鞘内不做任何处理，2天后制作脊髓缺血再灌注损伤，缺血再灌注损伤前和缺血再灌注损伤后1d，2d，7d各6只;PBS组:鞘内注射等容量PBS液，2天后制作脊髓缺血再灌注损伤，缺血再灌注损伤前和缺血再灌注损伤后1d，2d，7d各6只;Ad-GFP组:鞘内注射等容量Ad-GFP，2天后制作脊髓缺血再灌注损伤，缺血再灌注损伤前和缺血再灌注损伤后1d，2d，7d各6只;MSCs组:鞘内注射Ad-GFP转染MSCs，2天后制作脊髓缺血再灌注损伤，缺血再灌注损伤前和缺血再灌注损伤后1d，2d，7d各6只;NGF-MSCs组:鞘内注射Ad-GFP转染NGF-MSCs，2天后制作脊髓缺血再灌注损伤，缺血再灌注损伤前和缺血再灌注损伤后1d，2d，7d各6只。我们采用Tarlov神经功能评分法和下肢SEP监测神经功能变化，然后以GFP荧光（绿色）作为标记直接在荧光显微镜下观察NGF-MSCs在缺血再灌注损伤脊髓迁移、存活;采用免疫荧光技术和western-blot技术检测鞘内移植NGF-MSCs在缺血再灌注损伤脊髓分化和分泌功能。
　　Tarlov神经功能评分采用中位数统计分析，其余数据均以Mean±SD表示，用SPSS13.0统计软件处理，组内比较用t检验，组间比较用单因素方差分析，P＜0.05表示有显著性差异。
　　结果：
　　第一部分:NGF诱导培养MSCs在体外生长、分化、增殖和分泌的实验研究
　　我们在显微镜下观察并绘制生长曲线图发现NGF诱导培养MSCs的扩增能力提高4倍左右，P＜0.05。我们采用流式细胞仪检测第3代NGF诱导培养MSCs和DMEM/F12培养MSCs细胞表面标志物CD34、CD45和CD90表达率均符合国际细胞治疗协会的MSCs标准。细胞免疫荧光技术发现NGF诱导培养MSCs有神经元标志物NeuN呈红色荧光，同时可见细胞增殖标志物Ki67呈蓝色荧光，但是没有观察到星形胶质细胞标志物(GFAP)染色。MSCs组未见NeuN和GFAP呈阳性染色荧光，只观察到细胞增殖标志物Ki67呈蓝色荧光。实验中通过6组细胞免疫荧光染色统计分析计算出NGF诱导培养MSCs增殖标志物Ki67表达率为65.32±4.25％，MSCs增殖标志物Ki67表达率为45.63±3.82％，P＜0.05，有统计学差异;表明NGF诱导培养MSCs比MSCs的增殖能力更强。通过Real-time PCR实验检测发现，与MSCs组比较，NGF诱导培养MSCs表达BDNF、NGF和VEGFmRNA的水平更高，P＜0.05，有统计学差异。进一步采用ELISA实验检测发现，与MSCs组比较，NGF诱导培养MSCs分泌BDNF、NGF和VEGF的浓度更高，P＜0.05，有统计学差异。
　　第二部分:NGF诱导培养MSCs鞘内移植对兔脊髓缺血再灌注损伤影响的研究
　　实验中我们发现NGF诱导培养MSCs鞘内移植后脊髓缺血再灌注损伤兔下肢运动功能1d、2d和7d Tarlov评分均有所增加P＜0.05;并且动物下肢体感诱发电位潜伏期缩短，波幅增高;与con组和MSCs组比较，P＜0.05，具有统计学差异。我们以GFP荧光（绿色）作为标记通过脊髓切片观察发现NGF诱导培养MSCs比DMEM/F12培养MSCs在缺血再灌注损伤脊髓存活更多更久，且向脊髓灰质更深层迁移、存活。免疫荧光技术检测发现鞘内移植NGF诱导培养MSCs在缺血再灌注损伤脊髓有部分细胞向神经元样细胞分化。Western-blot技术检测发现MSCs组在脊髓缺血再灌注损伤后1d、2d和7d脊髓表达BDNF、NGF和VEGF蛋白含量比con组多，P＜0.05，具有统计学差异;同时发现NGF-MSCs组在脊髓缺血再灌注损伤后1d、2d和7d脊髓表达BDNF、NGF和VEGF蛋白含量比MSCs组更多，P＜0.05，具有统计学差异。
　　结论：
　　1、NGF诱导培养MSCs在体外向神经元样细胞分化的同时增殖能力增强，并分泌更多BDNF、NGF和VEGF;
　　2、NGF诱导培养MSCs鞘内移植后向缺血再灌注损伤脊髓灰质深层迁移、存活时间更长，部分向神经元样细胞分化;可能促进缺血再灌注损伤脊髓表达或自身分泌更多BDNF、NGF和VEGF;从而明显减轻脊髓缺血再灌注损伤导致的神经功能障碍。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 NGF诱导培养MSCs在体外生长、分化、增殖和分泌的实验研究

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

论文二 NGF诱导培养MSCs鞘内移植对兔脊髓缺血再灌注损伤影响的研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 骨髓间充质干细胞治疗中枢神经损伤机制的研究进展

在学期间科研成绩

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