布美他尼对大鼠脑缺血后神经发生及功能恢复的影响

摘要

目的：
　　中风是导致成人残疾的主要疾病。中风不但能够危及患者生命，根据病变位置及面积的不同，还会引起不同程度的持续终生的脑功能障碍，从而严重影响患者的生活质量。目前对脑梗死的治疗仍然是临床上的难点。在癫痫、中风等形式的脑损伤后，神经系统具有很强的可塑性，侧脑室下区和海马齿状回出现神经干细胞的增殖和分化并迁移到细胞变性及坏死区域[1]。但新生神经元的长期生存能力相对有限，表明脑卒中后存在不利于自我修复的局部微环境。因此探索新的脑缺血后神经元保护药物有着重要临床意义。
　　布美他尼是Na+-K+-2Cl-同向转运体(Na+-K+-2Cl-cotransporters，NKCCs)的特异性拮抗剂，在中枢神经系统主要拮抗细胞膜上的NKCC1，减少氯离子内流入细胞。大量研究表明在脑缺血的急性期，布美他尼能够通过抑制NKCC1，减少大鼠脑部的水肿及梗死的面积[2-4]。除此以外还有研究表明外伤后，应用布美他尼能够减少大鼠神经细胞的损伤[5]。以上所述表明布美他尼对脑神经有一定的保护作用。但是在脑缺血慢性期，关于布美他尼对大鼠神经发生及行为学恢复的作用仍不清楚。因此，本研究的目的是探讨布美他尼对局灶性脑缺血后大鼠神经发生及行为学恢复的影响。
　　方法：
　　1、实验动物的分组:采用雄性Wistar大鼠，体重200-250g，由中国医科大学实验动物中心提供，随机分为4组:(1)假手术组（SHAM）;(2)假手术+布美他尼组（SHAM+BUM）;(3)缺血组(ISC);(4)缺血加布美他尼组(ISC+BUM)。
　　2、颅内注射ET-1制作脑缺血模型:采用颅内注射内皮素-1（endothelin-1，ET-1）的方法制作脑缺血模型。根据大鼠脑解剖图谱，用立体定位的方法将内皮素-1注射到大鼠大脑皮质的运动区及纹状体区域以形成局部脑缺血。
　　3、5-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-bromodeoxyuridine，BrdU）示踪标记:在造模后第5天和第6天，向腹腔内注射BrdU100mg/kg标记神经干细胞，每天2次，间隔12小时，连续2天。
　　4、微量渗透泵颅内给药:在造模后第7天开始，用立体定位的方法在颈部皮下埋置灌注布美他尼的微量渗透泵，进行侧脑室内持续给药，连续21天。
　　5、组织切片的制备:以上各组动物分别于造模后第32天用多聚甲醛灌注固定，取脑，用恒冷切片机行连续脑冠状冰冻切片（片厚40μm）。
　　6、梗死体积的测量:使用尼氏染色测量缺血组、ISC+BUM组之间脑梗死的体积的差异。
　　7、免疫荧光染色:用免疫荧光法观察侧脑室下区BrdU/DCX，缺血灶周围BrdU/NeuN、BrdU/GFAP、BrdU/Ibal-1阳性细胞及大鼠海马齿状回DCX阳性细胞。
　　8、共聚焦显微镜成像:在共聚焦显微镜下获取海马齿状回区域DCX阳性细胞的Z轴方向系列图层后，对新生神经细胞树突及轴突进行三维重建，然后使用NIHImageJ软件对树突、轴突及其分支进行追踪描绘与测量，以观察DCX阳性细胞的树突发育成熟情况。
　　9、行为学测试:应用梯形平衡木行走实验对大鼠患侧肢体运动功能进行评价。应用Morris水迷宫实验对大鼠学习记忆能力进行评价。
　　10、统计学处理:实验数据以均值士标准差表示，P＜0.05有统计学差异。数据分析采用统计分析软件SPSS17.0 for windows进行。应用单因素方差分析或重复测量方差分析来判断差异的统计学意义。
　　结果：
　　1、梗死体积的测量。
　　缺血组、ISC+BUM组之间梗死体积没有明显差异（P＞0.05）。
　　2、布美他尼对侧脑室下区产生的新生神经前体细胞的增殖、分化、存活的影响。
　　DCX是神经前体细胞标记物，BrdU是细胞的标记物。BrdU/DCX双标阳性细胞代表缺血后出生的神经前体细。通过BrdU/DCX双染的阳性细胞数来观察新生神经前体细胞的增殖情况。侧脑室下区的BrdU/DCX阳性细胞在缺血组较假手术组及SHAM+BUM组明显增多(P＜0.01)。ISC+BUM组的BrdU/DCX阳性细胞数量与缺血组相比进一步增多(P＜0.01)。
　　NeuN为成熟神经细胞标记物，BrdU/NeuN双标阳性细胞代表脑缺血后出生的，已经发育成熟的神经细胞。通过BrdU/NeuN双染的阳性细胞数来观察新生神经细胞的长期存活情况。缺血组梗死灶周边的BrdU/NeuN的阳性细胞数较假手术组及SHAM+BUM组明显增多(P＜0.01)。与缺血组相比ISC+BUM组进一步增加了BrdU/NeuN的阳性细胞数(P＜0.01)。
　　Iba-1为小胶质细胞标记物，GFAP为星形胶质细胞标记物，通过BrdU/Iba-1和BrdU/GFAP的数量来观察布美他尼对脑缺血后新生小胶质细胞及新生星形胶质细胞的影响。与缺血组相比，布美他尼并没有改变新生小胶质细胞及新生星形胶质细胞的数量，两组之间的差异没有统计学意义（P＞0.05）。
　　3、布美他尼对脑缺血后海马齿状回神经前体细胞的增殖及树突发育的影响。
　　ISC+BUM组海马齿状回DCX阳性细胞数较缺血组明显增加(P＜0.01)，缺血组DCX阳性细胞数目较假手术组及SHAM+BUM组明显地增加(P＜0.01)。ISC+BUM组海马齿状回DCX阳性细胞的树突分支及长度较缺血组进一步增多（P＜0.05），缺血组海马齿状回DCX阳性细胞的树突分支及长度较假手术组及SHAM+BUM组明显增多（P＜0.01）。
　　4、布美他尼对脑血后大鼠运动神经功能及学习记忆功能恢复的影响。
　　通过平衡木行走测试来检测大鼠的运动神经功能恢复的情况。ISC+BUM组大鼠平衡木的错误百分率低于缺血组(P＜0.05)。通过水迷宫实验来检测大鼠的学习记忆功能的恢复情况。水迷宫实验中ISC+BUM组逃避潜伏期(P＜0.05)明显短于缺血组，空间探索试验中在给定时间内穿越平台的次数明显多于缺血组（P＜0.05）。
　　结论：
　　1、布美他尼促进了脑缺血后大鼠侧脑室下区新生神经细胞的增殖和存活。
　　2、布美他尼促进了脑缺血后大鼠海马齿状回神经前体细胞的增殖和树突发育。
　　3、布美他尼促进了脑缺血后大鼠运动功能及学习记忆功能的恢复。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 布美他尼对大鼠脑缺血后神经发生的影响

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

论文二 布美他尼对脑缺血后大鼠对神经功能恢复的影响

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

本研究创新性自我评价

综述 布美他尼与大鼠脑缺血后的神经发生

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