肝细胞癌基因甲基化谱的生物信息学分析及SLIT2基因甲基化检测的临床意义

摘要

目的：
　　本研究拟使用Infinium HumanMethylation450KBeadChip甲基化芯片检测肝细胞癌细胞系甲基化谱并进行生物信息学分析;对SGI-1027在肝细胞癌细胞系的去甲基化作用进行研究;同时检测肝细胞患者癌组织、血清和尿液中SLIT2基因启动子区甲基化情况并分析其临床意义。
　　方法：
　　一、甲基化芯片检测肝细胞癌细胞系DNA甲基化谱
　　1、使用Infinium HumanMethylation450K BeadChip甲基化芯片检测人肝细胞癌细胞系Huh7和人永生化肝细胞系L02全基因组DNA甲基化程度，筛选两者差异性甲基化位点及基因;2、对差异甲基化位点的分布情况和甲基化程度进行分析，明确Huh7细胞中差异甲基化位点的分布频率;3、同时，对差异甲基化基因的分布进行GO富集分析和KEGG Pathway分析，明确异常DNA甲基化对Huh7细胞生物学功能的影响。
　　二、甲基转移酶抑制剂SGI-1027的去甲基化作用及其对肝细胞癌细胞生物学行为的影响
　　1、实时定量PCR(Real-time PCR)检测Huh7细胞中DNMTs的表达情况;2、MTS法测定最佳给药浓度(IC50)同时观察SGI-1027去甲基化作用对Huh7细胞增殖活性的影响;3、Real-time PCR检测给予SGI-1027去甲基化后Huh7细胞中DNMTs mRNA表达水平的变化;4、Real-time PCR检测SGI-1027去甲基化后Huh7细胞中SLIT2基因mRNA的表达情况;甲基化特异性PCR(MSP)法检测SGI-1027对Huh7细胞中SLIT2基因的去甲基化作用;5、PI法和流式细胞仪检测技术检测SGI-1027去甲基化对Huh7细胞周期的影响;6、AnnexinⅤ-FITC/PI法和流式细胞仪技术检测SGI-1027去甲基化对Huh7细胞凋亡的影响;7、TUNEL染色荧光显微镜下观察SGI-1027去甲基化后Huh7细胞形态学变化;8、Transwell法观察SGI-1027去甲基化作用对Huh7细胞迁移作用的影响。
　　三、MSP检测肝细胞癌患者癌组织、癌旁组织、血清和尿液SLIT2启动子甲基化情况及其临床意义
　　使用针对SLIT2启动子区高频甲基化位点(21，22，23)设计SLIT2甲基化特异性引物，MSP技术检测肝细胞癌患者癌组织、癌旁组织、血清和尿液中SLIT2启动子甲基化情况，分析其临床意义。
　　四、统计方法
　　采用Illumina公司官方提供的Methylation Module of Genome Studio softwareMethylationv1.9软件对芯片数据进行分析。采用SPSS19.0统计软件对计量资料采用独立样本或配对T检验，结果以均数±标准差表示;单因素方差分析选用one- way ANOVA Dunnett test; SLIT2启动子甲基化表达及其与患者临床病理学参数的关系采用卡方检验，P＜0.05有统计学意义。检验一致性采用Kappa相关分析，Kappa系数＞0表示有相关性;检验相关性采用Spearman相关系数分析，Spearman系数＞0表示正相关。
　　结果：
　　1、在Huh7细胞和L02细胞中共检测到102，254个差异甲基化CpG位点（涉及26，511个基因）。其中高甲基化位点62，702(61.3％)个，涉及12，665个基因;低甲基化位点39，552(38.7％)个，涉及13，846基因。
　　2、差异性甲基化CpG位点中，41，178(40.3％)个位点位于CpG island，21，150(20.7％)个位点位于CpG N-shore和S-shore，9，030(8.8％)个位点位于CpGN-shelf和S-shelf,另外30，896(30.2％)个位点分布于Open sea。
　　3、甲基化差异位点中，有35，937(57.3％)个高甲基化CpG位点和15，587(39.4％)个低甲基化CpG位点的甲基化差异程度≥50％;18，529(29.5％)的高甲基化CpG位点和14，177(35.9％)个低甲基化CpG位点的甲基化差异程度≥30％但＜50％;8，236(13.1％)个高甲基化CpG位点和9，788(24.7％)个低甲基化CpG位点的甲基化程度＜30％但≥20％。
　　4、经过严格筛选后位于启动子区内的显著高甲基化CpG位点有2，334个，显著低甲基化位点为1，749个。在显著高甲基化CpG位点中检测到390个差异性甲基化区域（Differentially Methylated Regions，DMRs）覆盖287个显著高甲基化基因，显著低甲基化CpG位点中检测到208个DMRs覆盖203个显著低甲基化基因。
　　5、GO富集分析显示:富集于9个生化过程相关的差异性甲基化基因共有2，107个，富集于17个分子功能相关的差异性甲基化基因共有13，351个，富集于21个细胞成分有关的差异性甲基化基因共有18，041个。KEGG通路分析显示在220个信号通路中有43个信号通路出现差异性甲基化基因的富集，涉及5，195个基因。
　　6、Real-time PCR结果表明，Huh7细胞中DNMT1的表达量高于DNMT3a和DNMT3b;给予不同浓度SGI-1027处理24h后可观察到Huh7的增殖活性受到抑制，IC50为27.30μmol/l;给予最佳剂量的SGI-1027处理后发现DNMT1 mRNA表达量下降，SLIT2基因mRNA的表达量较未处理组增加，MSP结果显示SGI-1027处理后SLIT2启动子甲基化检测条带较对照组变暗;给予SGI-1027处理后的Huh7细胞凋亡率增加，但是细胞周期并无明显改变;荧光显微镜下观察TUNEL染色，发现给予SGI-1027处理后的Huh7细胞形态发生凋亡改变;Transwell结果显示给予SGI-1027处理后，Huh7细胞的迁移能力减弱。
　　7、肝细胞癌患者癌组织、血清和尿液中均可检测到SLIT2启动子甲基化状态的存在，阳性率分别为81.7％、68.3％和47.5％。在肝细胞癌患者癌组织中，SLIT2启动子甲基化分别与HBV感染和AFP水平有关;在血清和尿液中则与HBV感染有关。
　　8、对癌组织、血清及尿液样本中SLIT2启动子甲基化检出情况进行Kappa一致性检验分析，结果显示;癌组织与血清中SLIT2启动子区甲基化结果间的Kappa系数为0.219;癌组织与尿液中SLIT2启动子区甲基化结果间的Kappa系数为0.136;血清与尿液中SLIT2启动子区甲基化结果间的Kappa系数为0.252，Kappa系数均大于0，三种检测结果之间具有一定一致性。HBV病毒拷贝数与SLIT2启动子甲基化情况进行Spearman相关性分析结果显示;相关系数为0.181，HBV病毒拷贝数与SLIT2启动子甲基化检出率呈正相关。
　　结论：
　　1、肝细胞癌细胞中，DNA异常高甲基化是一个重要的频发事件，且多发生于基因的启动子区，是影响基因的转录活性的主要因素。
　　2、差异性甲基化基因在生化进程、分子功能和细胞成分相关功能区的富集和在多条癌症相关通路中的富集说明基因异常甲基化可能是影响肝细胞癌发生发展的重要表观遗传学机制。
　　3、甲基转移酶抑制剂SGI-1027能够抑制DNMT1 mRNA的表达从而抑制DNA甲基化，并能逆转SLIT2启动子区高甲基化状态;给予SGI-1027去甲基化后Huh7细胞凋亡增加，增殖和迁移能力减弱。
　　4、我们研发的尿液甲基化DNA富集体系能够稳定、高效地提取肝细胞癌患者尿液中存在的游离DNA片段，并能够进行DNA甲基化的后续试验。
　　5、针对SLIT2启动子区高频甲基化位点(21，22，23)设计的甲基化特异性引物对肝细胞癌组织中SLIT2启动子甲基化检出阳性率高，说明SLIT2启动子甲基化在肝细胞癌中是一个高频事件;肝细胞患者尿液和血清样本中可检测到SLIT2启动子甲基化，并与癌组织的检出情况具有一致性。
　　6、肝细胞癌组织、血清和尿液中SLIT2启动子甲基化情况与HBV病毒拷贝数呈正相关，提示在HBV感染时期可能就已经存在SLIT2启动子区异常高甲基化改变。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 肝细胞癌基因甲基化芯片的生物信息学分析

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

论文二 甲基转移酶抑制剂SGI-1027对肝细胞癌细胞生物学行为的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

论文三 肝细胞癌患者癌组织、血清及尿液中SLIT2基因甲基化检测及其临床意义

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

本研究创新的自我评价

综述 DNA甲基化与肝细胞癌

在学期间科研成绩

致谢

个人简历