IL28B基因多态性及其表达与慢性丙型肝炎的相关性研究

摘要

丙型病毒性肝炎是由丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)引起的慢性传染性疾病，目前世界上约有1.7亿人感染HCV，中国约有3700～4000万。HCV感染后，20％～30％感染者会发生自发性清除，但70％～80％将会持续感染，如得不到合理治疗将有30％的持续感染者最终会发展成肝硬化和肝癌。不同个体患者对联合治疗的应答存在较大的差异，近几年来宿主因素越来越多引起关注，例如性别、年龄、种族和肝纤维化程度。最近，几个全基因组关联研究发现IL28B基因(编码干扰素λ3)附近的几个单核苷酸多态性(SNP)与HCV病毒自发性清除、慢性感染发生率和干扰素联合利巴韦林治疗的效果有十分密切的关联。相关研究表明，在丙型肝炎人群中，IL28B基因多态性与HCV自发清除及能力有关，自发性清除组和健康对照组人群中IL28B血清学水平和mRNA表达明显高于慢性HCV持续感染组。IL28B基因主要与受体IL10RB和IL28RA结合结合，启动JAK-STAT途径，通过调节ISGs发挥抗病毒作用。
　　研究发现，携带rs8099917 TT基因型的在丙型肝炎患者，其肝脏中IL28B和主要抗病毒干扰素刺激基因(MxA，PKR，OAS1，ISG15)的mRNA表达显著低于携带GT/GG的患者;同时在PBMC中的表达则没有显著性差异;可以通过检测肝脏内的IL28B和ISGs的表达预测干扰素抗病毒治疗应答。有研究表明，外周血单个核细胞内的IL28B和ISGs的表达也与持续性病毒应答相关，并且体内和体外的表达是一致的，可以通过体外培养PBMC，检测IL28B和ISGs的mRNA表达预测患者接受聚乙二醇干扰素抗病毒治疗应答。
　　目的：
　　本研究主要检测了IL28B及其受体IL10RB和IL28RA的多个SNP，分析不同基因型在对照组和病例组中的基因型频率分布差异，探讨基因多态性与HCV疾病易感性的关系。IFN-α激活JAK-STAT信号通路，导致超过500多个干扰素刺激基因ISGs的上调，其中MxA、OAS1和PKR是最明显的3个基因，可以被干扰素诱导分泌显著上调，具有直接抗病毒作用。因此，我们可以检测外周血单个核细胞中IL28B及相关ISGs的mRNA表达和血清IL28B含量，分析其在HCV感染中可能发挥的作用，为更详尽的治疗HCV提供分子生物学依据。
　　方法：
　　该病例对照研究收集中国医科大学附属第一医院从2009年11月到2012年4月就诊的丙型肝炎患者271例，同期健康体检者300。患有以下疾病的病例被排除在外:乙型肝炎、人类免疫缺陷疾病、其他类型的肝脏疾病，例如自身免疫性肝病、酒精性肝病或者肝脏代谢疾病等。抽取患者2毫升静脉血，提取基因组DNA，采用高分辨率熔解曲线的方法检测IL28B单核苷酸多态性位点(rs12979860，rs8099917，rs12980275，rs11881222)及其受体IL28RA(位点rs11249006)和IL10RB的位点(rs2834167)，分析这6个SNP的基因型和等位基因分布频率在病例组和对照组之间差异，探讨SNP在HCV疾病易感性方面的相关性。从病例组和对照组中随机抽查40个的标本，采用直接测序（上海生工）的方法，验证HRM试验结果的准确性。
　　选取22例HCV-RNA阳性，15例HCV-RNA阴性和45例健康对照样品，提取外周血单个核细胞，提取总的RNA，通过RT-PCR的方法检测IL28B以及相关ISGs(MxA，OAS1，PKR)的mRNA表达。收集所有病例组和对照组的血清标本，采用ELISA方法检测IL28B的血清水平，分析IL28B在HCV清除中的作用以及不同基因型之间IL28B的表达是否存在差异。
　　分组选择HCV RNA阳性4名，RNA阴性8名和健康对照12名，分离他们的外周血单个核细胞后，体外刺激培养poly(I∶C)刺激4小时后检测PBMC中IL28B、MxA和OAS1的mRNA表达，24小时后检测上清液中IL28B的蛋白含量，分析其在预测HCV抗病毒治疗应答方面的作用。
　　结果：
　　所有6个SNP对照组的基因型分布频率均符合HWE(P值大于0.05)，说明对照组可以代表该地区人群。IL28B的4个SNP基因型分布显示HCV病例组的杂合子基因型频率显著高于对照组，存在显著性差异(rs1188222 AG基因型OR=2.06，95％CI=1.26-3.37，P=0.00346; rs12979860 CT基因型，OR=2.01,95％CI=1.26-3.37，P=0.00346;rs12980275AG基因型，OR=2.01,95％ CI=1.24-3.35,P=0.00389; rs8099917 GT基因型，OR=2.21,95％CI=1.33-3.68，P=0.00193)。IL10RB的SNP位点rs2834167和L28RA的SNP位点rs11249006位点的基因型和等位基因频率分布在HCV病例组和对照组没有显著差异。单倍型AACT在HCV感染中发挥保护性作用，健康对照组中单倍型AACT的频率显著高于HCV感染组(OR=1.91,95％CI1.20-3.03，P=0.00551)。
　　健康对照组IL28B的mRNA表达显著高于HCV-RNA阳性组，具有统计学意义(P=0.025)。同时各组之间的IL28B血清水平也有显著性差异，健康对照组最高(68.70±50.26 ng/L)，HCV-RNA阴性组较高(42.03±38.20 ng/L)，HCV-RNA阳性组最低(17.77±5.68 ng/L)。不同IL28B基因型对mRNA的表达以及血清水平有影响，但是没有统计学意义。各组中，抗病毒相关ISGs(MxA，OAS1，PKR)的表达没有显著性差异。
　　体外刺激培养PBMC检测结果显示，HCV病例组的IL28B、MxA和OAS1的mRNA表达显著高于健康对照组（P值分别是0.067、0.030和0.006），携带保护性等位基因的个体其mRNA相对表达较高，但是没有统计学意义。
　　结论：
　　1、IL28B基因rs1188222 AG基因型，rs12979860 CT基因型，rs12980275 AG基因型和rs8099917 GT基因型在HCV病例组显著高于对照组，可能在疾病感染中是危险因素，与HCV疾病易感性相关。
　　2、IL10RB(rs2834167)和L28RA(rs11249006)位点的基因型和等位基因频率分布在HCV病例组和对照组没有显著差异，未发现其与HCV疾病易感性之间的关联。
　　3、与健康对照组相比，HCV RNA阳性组的PBMC中IL28B的mRNA相对表达较低，存在显著性差异;并且IL28B血清水平也较低，有显著性差异。IL28B基因编码干扰素λ，在HCV病毒清除方面发挥一定的功能。
　　4、IL28基因CC型和CT/TT型个体比较，IL28B的mRNA表达和血清水平没有显著性差异，单核苷酸多态性变异对于IL28B的表达和功能不起决定性作用。
　　5、各组中，相关干扰素刺激基因MxA、OAS1和PKR的mRNA表达没有显著性差异。
　　6、体外刺激培养PBMC后检测mRNA的表达显示，HCV病例组中IL28B的表达较高，具有清除HCV病毒方面的作用，但是不同IL28B基因型个体之间没有显著性差异。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 白介素28B及其受体单核苷酸多态性与丙型肝炎易感性的相关性研究

前言

研究资料和方法

结果

讨论

结论

论文二 白介素28B及相关ISG在PBMC中的表达与丙型肝炎的相关性研究

前言

研究资料和方法

结果

讨论

结论

论文三 体外PBMC的IL28B表达与丙型肝炎的相关性研究

前言

研究资料和方法

结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 白介素28B基因多态性与丙型肝炎相关性的研究进展

在学期间科研成绩

致谢

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