CYP2E1在1,2-二氯乙烷中毒性脑水肿形成机制中的作用研究

摘要

目的：
　　1，2-二氯乙烷(1，2-Dichloroethane，1，2-DCE)是一种卤代烃类化合物，主要用于粘合剂、胶粘剂和氯乙烯的生产。1,2-DCE属高毒类，极易挥发，职业接触主要经呼吸道吸收。自上世纪90年代起，国内多个省份陆续发生多起亚急性1，2-DCE职业中毒事故，引起了全社会的广泛关注。这些中毒患者的临床表现以中毒性脑病为主，病理过程为脑水肿。
　　CYP2E1是细胞色素P450(Cytochrome P450，CYP450)的重要亚型，是卤代烃类化学物质的主要代谢酶之一。1，2-DCE可经CYP2E1代谢生成毒性更强的中间产物氯乙醛和2-氯乙醇，并最终代谢为氯乙酸随尿液排出体外。此外，与其他CYP450亚型相比，CYP2E1具有较强的NADPH氧化酶活性，在代谢底物的过程中可产生大量活性氧自由基，导致组织细胞的氧化损伤。
　　许多CYP2E1底物也能影响CYP2E1的表达，进而影响化学物质在体内的代谢和毒性作用。已有研究证明，CYP2E1抑制剂能通过抑制CYP2E1的表达，进而对外源性化学物的肝毒性和致癌作用具有保护作用。二烯丙基硫化物(Diallylsulfide，DAS)是一种大蒜提取物，是目前公认的CYP2E1抑制剂。我们的前期研究结果也提示，外源性DAS能抑制CYP2E1的表达，进而改善1，2-DCE染毒所致肝损伤。
　　综上所述，本研究以昆明种小鼠为实验对象，探讨CYP2E1在1，2-DCE中毒性脑水肿形成中的作用，为揭示1，2-DCE中毒性脑水肿的形成机制研究及其防治工作提供实验参考依据。
　　方法：
　　1、CYP2E1对1，2-DCE体内代谢产物的影响
　　将雌性昆明种小鼠随机分为单纯染毒组及干预组。将DAS溶解于玉米油中，于1，2-DCE染毒前4小时，干预组小鼠灌胃给予50mg/kg b.w DAS，单纯染毒组小鼠灌胃给予玉米油。灌胃的液体体积均为0.2ml。采用静式吸入方式染毒，每天染毒3.5h，连续染毒3d，1，2-DCE染毒浓度为1.2g/m3，每天染毒结束后立即将小鼠置于代谢笼中，收集小鼠3h尿液。
　　2、CYP2E1抑制剂对1，2-DCE染毒小鼠死亡及行为学的影响
　　将雌性昆明种小鼠随机分为4对单纯染毒组及相应的干预组。单纯染毒组小鼠灌胃给予玉米油，干预组小鼠灌胃给予50mg/kg b.w DAS。1，2-DCE染毒浓度分别为1.3、1.5、1.7和1.9g/m3，每天染毒3.5h，连续染毒3d，每天染毒结束后，记录小鼠死亡情况。于末次染毒结束后对存活小鼠进行脑损伤的行为学观察。
　　3、CYP2E1抑制剂对1，2-DCE中毒性脑水肿形成的影响
　　将雌性昆明种小鼠随机分为对照组、单纯染毒组及低、中和高剂量DAS干预组。对照组和单纯染毒组灌胃给予玉米油。干预组小鼠分别灌胃给予25、50和100 mg/kg b.w DAS。1，2-DCE染毒浓度为1.2g/m3，每天染毒3.5 h，连续染毒3d。于末次染毒的次日处死小鼠，快速取脑和肝组织进行相关指标的检测。
　　4、检测指标
　　(1)脑含水量:脑组织含水量(％)=（湿重-干重）×100/重。
　　(2) GSH含量、MDA含量、SOD活性及肌酐含量:生化试剂盒法。
　　(3)肝微粒体中CYP2E1活性:苯胺羟化酶法。
　　(4)肝和脑组织中CYP2E1的蛋白表达:Western-blot法。
　　(5)肝和脑组织中CYP2E1 mRNA的表达:Real-time PCR。
　　(6)脑组织病理学观察:常规HE染色法。
　　(7)尿中氯乙酸含量:气相色谱法。
　　(8)小鼠脑损伤行为学观察:Berderson评分法。
　　5、统计分析
　　采用统计分析软件SPSS18.0对实验数据进行处理和分析，正态分布资料用均数±标准差表示，偏态分布资料经对数转换后用几何均数±标准差表示。多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，两两组间比较采用SNK法，以P＜0.05作为显著性差异的判定标准。
　　结果：
　　一、CYP2E1对1，2-DCE染毒小鼠体内1，2-DCE代谢的影响
　　1，2-DCE染毒组小鼠的尿中氯乙酸含量随着染毒天数的增加而显著升高，而干预组小鼠的尿中氯乙酸含量在染毒期间无明显变化。此外，从染毒第2d开始，干预组小鼠的尿中氯乙酸含量显著低于1，2-DCE染毒组。
　　二、CYP2E1抑制剂对1，2-DCE染毒小鼠死亡及行为学的影响
　　1、CYP2E1抑制剂对1，2-DCE染毒小鼠死亡率的影响
　　随着染毒剂量的不断增加，1.3、1.5、1.7和1.9g/m31，2-DCE染毒组小鼠的死亡率不断升高。当1，2-DCE染毒剂量为1.9g/m3时，单纯染毒组小鼠的死亡率为80％，而干预组仅为10％，且两组的死亡率比较差异有统计学意义。
　　2、CYP2E1抑制剂对1，2-DCE染毒小鼠行为学的影响
　　将小鼠尾巴轻轻提起使小鼠头朝下悬空，正常小鼠四肢能够自然伸展。单纯染毒组小鼠出现肢体震颤、四肢不能完全伸展，双前肢和/或双后肢相互交叉的抱爪现象，即出现脑损伤的行为学异常表现。
　　对存活小鼠出现脑损伤行为学改变（抱爪症状）的数量进行统计分析，单纯染毒组的存活小鼠中出现脑损伤行为学异常表现的比例随着1，2-DCE染毒剂量的增加而不断升高。其中，当染毒剂量为1.3、1.5和1.7g/m3时，与单纯染毒组比较，干预组小鼠出现脑损伤行为学异常的比例显著下降。而1.9g/m31，2-DCE单纯染毒组与干预组比较差异无统计学意义。
　　三、CYP2E1抑制剂对1，2-DCE中毒性脑水肿形成的影响
　　1、小鼠染毒期间的体重变化
　　与对照组相比，单纯染毒组小鼠在染毒的第2d体重显著下降，各干预组小鼠在染毒的第3d体重显著下降。与单纯染毒组相比，中和高剂量干预组小鼠体重明显增加。
　　2、CYP2E1抑制剂对1，2-DCE染毒小鼠肝和脑组织中CYP2E1表达的影响
　　与对照组相比，单纯染毒组小鼠肝微粒体中CYP2E1酶活性、肝和脑组织中CYP2E1蛋白和mRNA表达显著升高。与单纯染毒组相比，微粒体中CYP2E1酶活性、肝和脑组织中CYP2E1蛋白和mRNA表达明显下降。
　　3、CYP2E1抑制剂对1，2-DCE染毒小鼠脑水肿发生的影响
　　病理学观察发现，单纯染毒组小鼠的脑组织中，细胞间质疏松，细胞核周围腔隙增宽，胞浆淡染，胞体肿胀变性，边缘模糊，部分细胞及毛细血管周围腔隙扩张，呈现典型的脑水肿病理改变。干预组小鼠的脑组织病理学观察未见明显的脑水肿病理改变。
　　与对照组相比，单纯染毒组小鼠的脑含水量显著升高。与单纯染毒组相比，中和高剂量DAS干预组小鼠脑含水量显著下降。
　　4、CYP2E1抑制剂对1，2-DCE染毒小鼠脑组织氧化损伤的影响
　　与对照组比较，单纯染毒组小鼠脑组织中MDA含量显著升高，而GSH含量显著下降。各干预组小鼠的脑组织中MDA含量与单纯染毒组比较均显著降低，而GSH含量均显著升高。各组小鼠脑组织中SOD活性的差异均无统计学意义。
　　结论：
　　1、1，2-DCE染毒可明显诱导小鼠肝和脑组织中CYP2E1的表达，促进1，2-DCE的体内代谢。
　　2、DAS可通过抑制小鼠肝和脑组织中CYP2E1的表达，预防1，2-DCE中毒性脑水肿的发生。
　　3、CYP2E1介导的1，2-DCE代谢过程可能是1，2-DCE中毒性脑水肿形成的主要机制之一。

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综述 细胞色素P450 2E1介导外源性化合物毒性损伤研究进展

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