伯氏疟原虫新型传播阻断疫苗候选蛋白PbA_320与PbA_100的确定

摘要

目的：
　　疟疾(Malaria)是疟原虫经媒介按蚊叮咬而传播的一种虫媒传染病，是最为致命的原虫感染性疾病。每年约造成60万人死亡，疟疾已成为全球最严重的公共卫生问题之一，给全球尤其是发展中国家带来了沉重的健康危害和严重的经济负担。尽管因应用最新推出的以青蒿素为基础的联合疗法(ACTs)，疟疾的死亡率已经大大降低，但最近在东南亚一些国家发现了针对青蒿素这一联合疗法的主要成分所产生的耐药性的现象。这就使得研发安全有效的疟疾疫苗成为当前全球疟疾防治的迫切需求。目前，正在研究的疟疾疫苗主要包括红前期疫苗、红内期疫苗和传播阻断疫苗。其中传播阻断疫苗(Transmission Blocking Vaccine，TBV)被认为是一种在疟疾流行地区降低病原体传播的可行策略，其基本原理是用疟原虫有性阶段和蚊阶段的表面抗原免疫个体，诱导抗体产生，抗体随血液被蚊吸食后，可阻止疟原虫在蚊体内的后续发育，从而切断疟原虫的传播。TBV候选抗原主要分为配子受精前期靶抗原、受精后期靶抗原和蚊虫中肠靶抗原，因候选抗原不受脊椎动物免疫系统选择压力的影响，而显示出较低的多态水平，抗原不易出现变异的情况，更有利于疫苗的免疫效果，因此TBV是疟疾疫苗研究的热点。目前，已研究发现了一些具有传播阻断作用的TBV抗原，但数量有限，且这些候选抗原均存在一定的缺陷，不能完全阻断疟疾的传播。因此，筛选并增加新型疟原虫TBV候选抗原尤为重要。
　　本试验选取了伯氏疟原虫(Plasmodium berghei)有性发育阶段的特异性膜蛋白PbA_320(PBANKA_114320)与PbA_100（PBANKA_093100），应用原核表达系统表达PbA_320蛋白，应用毕氏酵母表达系统表达PbA_100蛋白。分别将两者免疫小鼠后，获取免疫血清以确定候选抗原的表达阶段及传播阻断能力。同时，应用基因敲除技术靶向敲除了pba_320与pba_100基因，对两者的生物学功能进行初步研究，以期为传播阻断疫苗的进一步研究提供参考。
　　方法：
　　一、生物信息学分析
　　采用在线预测网(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)对伯氏疟原虫传播阻断疫苗的候选蛋白PbA320、PbA100的功能域进行预测;采用在线预测网（http://imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pldu）进行抗原决定簇的预测。
　　二、原核表达载体的构建及蛋白的获取
　　1、伯氏疟原虫cDNA的获取
　　伯氏疟原虫感染6-8周的雌性的BALB/c小鼠，感染后第四天小鼠眼球取血，提取疟原虫的RNA，使用反转录试剂盒将其反转录成cDNA，获得疟原虫基因组cDNA。
　　2、应用PCR方法扩增目的基因片段
　　根据目的片段设计带有BamHⅠ与NotⅠ酶切位点的引物，通过聚合酶链式反应(PCR)获得大量的目的片段
　　3、PCR产物的纯化
　　根据琼脂糖凝胶回收试剂盒说明书对琼脂糖凝胶电泳后的PCR产物进行回收与纯化。
　　4、原核表达载体的构建
　　选择在大肠杆菌中可以大量表达的原核载体PET32a(+)作为表达载体，将目的片段克隆至载体，并导入大肠杆菌DH5a中，通过PCR鉴定、酶切鉴定及测序鉴定，最终获得构建正确的表达载体PET32a-320。
　　5、原核重组蛋白的表达及纯化
　　将测序鉴定正确的原核表达载体转入蛋白表达菌株Rosetta-gami B(DE3)中，经IPTG诱导表达重组蛋白，经过SDS-PAGE电泳鉴定正确后，收集重组蛋白并进行纯化。
　　三、酵母表达载体的构建及蛋白的获取
　　1、目的基因的扩增及载体构建
　　应用上述方法获取伯氏疟原虫cDNA，根据目的片段设计引物，通过聚合酶链式反应(PCR)获得大量的目的片段。将基因片段克隆至酵母表达载体PPIC3.5K，构建载体PPIC3.5K-pba_100，并对载体进行鉴定。
　　2、质粒大量制备
　　将构建正确的表达载体PPIC3.5K-pba_100转化至TOP10菌株中，并对转化成功的菌株进行鉴定。鉴定正确后进行质粒大提，将质粒浓度调整至10 ug/ul左右。
　　3、表达载体的电转化
　　制备GS115细胞感受态，并将细胞在YPG液体培养基中培养。将PPIC3.5K-pba_100质粒用Sac1酶进行线性化，回收后用Eppendorf电转化仪电转化PPIC3.5K-pba_100于GS115感受态中，涂布150 uL转化后的菌液于RDB+G418平板上。
　　4、PPIC3.5K-pba_100的表达
　　挑取RDB+G418平板上的单菌落进行PCR鉴定，将PCR鉴定为阳性的菌株在YPG液体培养基中培养48h，静置5-6小时，倒掉试管中的上清，加入含1％甲醇的YP培养24h。经5％甲醇的YP进行诱导24h后，裂解细胞，对裂解液进行SDS-PAGE电泳确定表达量。
　　5、摇瓶发酵与蛋白纯化
　　将上述表达量较高的菌株进行大量发酵培养，收集培养后的细菌，裂解细菌后用透析柱将上清浓缩至200mL，并进行下一步的蛋白纯化。
　　四、重组蛋白的动物免疫及抗血清的获得
　　1、动物免疫
　　6-8周的雌性的BALB/c小鼠15只，分成3组，每组5只，1、2组分别注射两种重组蛋白，3组注射空载体蛋白作为对照组。初次免疫与加强免疫间隔2星期，共免疫三次。
　　2、免疫血清的收集及血清特异性抗体滴度的检测
　　第三次免疫后第十天取少量尾血获得少量血清，用酶联免疫吸附的方法检测血清中的抗体滴度。待抗体滴度有大幅度提升后，将小鼠眼球取血获得大量抗血清进行后续定位及阻断试验。
　　五、PbA_320、PbA_100蛋白表达阶段的确定
　　通过Western blot（免疫印迹法）及IFA（间接免疫荧光法）对目的基因进行定位。
　　结果：
　　一、原核表达载体的构建及重组蛋白的表达与纯化
　　通过PCR方法成功获取了pba_320基因片段(579 bp)，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后，对比DL2000 Marker，大小与预测结果一致。使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收PCR产物。用BamHⅠ与NotⅠ酶对回收产物进行酶切，得到带有酶切位点的目的片段。将空的原核载体PET32a(+)用BamHⅠ与NotⅠ双酶切后，得到末端与目的片段末端一致的线状空载体。使用连接酶SolutionⅠ将空载体与目的片段相连接，经测序鉴定正确后得到重组质粒P ET32a-pba-320。
　　将重组质粒导入大肠杆菌Rosetta-gami B(DE3)中，经IPTG诱导后裂解细菌，收集上清液。将收集的样品进行SDS-PAGE电泳，结果显示，表达后的蛋白与预测蛋白大小一致。大量收集样品，使用镍氨三乙酸琼脂糖柱进行纯化，得到大量高纯度的重组蛋白。
　　二、酵母表达载体的构建及蛋白纯化
　　通过PCR方法获得大量的目的片段，成功将基因片段克隆至酵母表达载体PPIC3.5K，完成了载体PPIC3.5K-pba_100的构建，经酶切与测序鉴定，载体构建正确。
　　成功制备GS115细胞感受态，并将线性化的PPIC3.5K-pba_100质粒转染至GS115感受态中。SDS-PAGE电泳结果显示，经5％甲醇的YP进行诱导24 h后目的蛋白得到了大量表达。经纯化后得到了80％纯度的目的蛋白。
　　三、重组蛋白的免疫原性检测
　　分别用PbA_320、PbA_100免疫小鼠，经三次免疫后收集血清。用重组蛋白包板，ELISA检测动物免疫血清的抗体滴度，结果显示两个重组蛋白的抗体水平均有大幅度提高，表明重组蛋白具有较好的免疫原性。
　　四、PbA_320、PbA_100基因的定位
　　采用Western blot及IFA方法检测两种重组蛋白在疟原虫发育的表达阶段。结果显示两个目的基因在裂殖体、配子体、动合子三个阶段均有表达。
　　五、候选蛋白的阻断能力
　　分别用PbA320、PbA100免疫血清在体外培养动合子，用抗Pbs21抗体来标记动合子，在荧光显微镜下观察动合子数量。结果显示，抗PbA_320抗血清与抗PbA_100抗血清均能明显减少动合子的形成，与对照组相比具有统计学意义。
　　六、基因的功能性研究
　　应用同源重组的方法，分别将候选基因pba_320与pba_100从疟原虫的基因组中敲除，分别获得了pba_320与pba_100基因缺失型的疟原虫。生物学功能研究结果显示，PbA_320对疟原虫的疟疾血症与小鼠鼠的生存率无明显影响，但对配子体出丝有重要影响。PbA_100对疟原虫的疟疾血症与小鼠鼠的生存率无明显影响，但其缺失可减少部分动合子的形成。
　　结论：
　　1、PbA_320与PbA_100蛋白均具有良好的抗原性。
　　2、PbA_320与PbA_100蛋白在裂殖体、配子体、动合子三个阶段均有表达。
　　3、抗PbA_320抗体可减少配子体出丝及动合子的形成，抗PbA_100抗体可减少动合子的形成。
　　4、成功获得了基因敲除型疟原虫株△pba_320与Apba_100。
　　5、PbA_320可影响配子体出丝;PbA_100对动合子的形成有重要影响。两者均可以作为TBV的候选抗原。

目录

声明

摘要

英文缩略语

前言

材料与方法

一、材料

二、方法

结果

一、PbA_320与PbA_100的生物信息学分析

二、原核表达载体PET32a(+)-320的构建

三、原核表达系统表达与纯化重组蛋白PbA_320

四、酵母表达系统表达与纯化PbA_100蛋白

五、蛋白兔疫及抗原性检测

六、PbA_350与PbA_100表达阶段的确定

七、传播阻断效应的验证

八、Δpba_320与Δpba_100基因敲除型疟原虫株的获取

九、pba_320与pba_100基因的功能研究

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 疟原虫的有性发育及传播阻断疫苗研究进展

致谢

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