转录因子SP1在头颈鳞状细胞癌中对microRNA-92b的调控作用

摘要

目的:探究肿瘤相关转录因子SP1与icroRNA-92b基因启动子区域的结合位点，以及转录因子SP1对microRNA-92b的转录调控作用，进一步探索肿瘤相关转录因子SP1（Specificity protein1，SP1）在头颈鳞状细胞癌(head and neck squamous cellcarcino a,H SCC)中对癌细胞增殖、转移、侵袭能力的作用，从而探究其转录因子SP1和microRNA-92b之间可能的分子机制以研究头颈鳞状细胞癌新的治疗靶基因。
　　研究方法:应用生物信息学方法获得microRNA-92b基因启动子区域并对其潜在的SP1结合位点进行预测。向头颈鳞状细胞癌PCI-4A和PCI-37A细胞中瞬时转染SP1 siRNA及negative contol siRNA(NC siRNA)24h、48h、72h、96h后，用细胞增殖CCK8实验研究SP1对头颈鳞状细胞癌细胞的增殖能力的调控。向头颈鳞状细胞癌PCI-4A和PCI-37A细胞中瞬时转染SP1 siRNA及negative contol siRNA24h后，采用Transwell迁移实验研究转录因子SP1对HNSCC癌细胞的迁移能力的调控。瞬时转染36h后，采用Transwell侵袭实验研究转录因子SP1对HNSCC癌细胞的侵袭能力的作用。根据预测的结合位点设计引物，进一步采用SP1抗体染色质免疫共沉淀技术结合PCR技术检测microRNA-92b基因启动子序列，以确定转录因子SP1与microRNA-92b基因启动子的结合。向头颈鳞状细胞癌PCI-4A和PCI-37A细胞中瞬时转染SP1 siRNA及negative contolsiRNA24h后收集RNA，利用real-time PCR检测转录因子SP1和microRNA-92b的mRNA表达水平以探究肿瘤相关转录因子SP1对microRNA-92b表达的调控作用。
　　结果:1、应用NCBI基因组数据库及Ensembl在线软件系统预测出miRNA-92b基因的启动子序列，在该启动子区域存在多个转录因子如E2F1、ETS1、MAX、PAX5、TFAP2A及NF-kappaB等的结合位点，而在启动子区域的592bp至601bp之间存在SP1结合的经典核苷酸序列GGGCGG，在其他多个区域也发现了类似这一经典序列的DNA序列。2、向HNSCC细胞PCI-4A和PCI-37A中瞬时转染了SP1 siRNA抑制转录因子SP1的表达后，细胞增殖实验CCK8显示转染SP1 siRNA实验组的癌细胞增殖能力显著低于阴性对照组(P＜0.05)和未作处理的空白对照组(P＜0.05)。3、向HNSCC细胞PCI-4A和PCI-37A中瞬时转染了SP1 siRNA抑制转录因子SP1的表达后，Transwell迁移和侵袭实验显示转染SP1 siRNA实验组的癌细胞迁移和侵袭能力都显著低于阴性对照组(P＜0.05)和未作处理的空白对照组(P＜0.05)。4、采用染色质免疫沉淀技术结合PCR扩增技术的方法对HNSCC细胞PCI-4A进行分析，结果显示转录因子SP1可与HNSCC细胞PCI-4A中microRNA-92b基因启动子区域DNA片断结合，并且至少有三个结合位点。5、向HNSCC细胞PCI-4A和PCI-37A中瞬时转染了SP1 siRNA抑制转录因子SP1的表达后，real-timePCR结果显示转染SP1 siRNA组的SP1和microRNA-92b表达水平都明显低于转染negtive control siRNA的对照组(P＜0.05)。
　　结论:1、SP1可与头颈鳞状细胞癌细胞的microRNA-92b基因启动子结合，是microRNA-92b基因上游的转录因子。2、转录因子SP1促进了HNSCC细胞的增殖、迁移以及侵袭的能力。3、肿瘤相关转录因子SP1的表达水平增加，使microRNA-92b的表达水平也增加，这说明在肿瘤发生中SP1直接参与miRNA-92b的转录调控。4、肿瘤发生时转录因子SP1促进了microRNA-92b的表达，说明转录因子SP1和microRNA-92b都极有可能是治疗HNSCC新的靶分子。

目录

声明

摘要

英文缩略语

1 前言

2．1．1主要试剂

2．1．2 主要仪器

2．2 研究对象和分组

2．3 实验方法及步骤

2．3．1 头颈鳞状细胞癌细胞培养

2．3．2 细胞的瞬时转染

2．3．3 细胞增殖实验

2．3．4 Transwell迁移实验

2．3．5 Transwell侵袭实验

2．3．6 染色质免疫共沉淀反应(CHIP)

2．3．7 Real-time PCR

2．3．8 统计学分析

3 结果

3．2 SP1对头颈鳞癌细胞增殖的影响

3．3 SP1对头颈鳞癌细胞迁移的影响

3．4 SP1对头颈鳞癌细胞侵袭的影响

3．5 CHIP表明SP1与microRNA-92b启动子序列有结合位点

3．6 SP1直接促进了microRNA-92b的转录

4 讨论

5 结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 MicroRNA和SP1在癌细胞侵袭转移关系的研究进展

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

个人简历