胶质瘤中启动子甲基化和转录因子Sp1对MAGE--D4的转录调控作用

摘要

目的: 探讨MAGE-D4启动子甲基化和转录因子Sp1对MAGE-D4启动子活性的影响。 方法: 1.生物信息学分析:通过公共数据库查询分析MAGE-D4启动子区域及转录因子结合位点，MAGE-D4/Sp1表达及相关性等。 2.甲基化质谱分析:提取50例胶质瘤组织和9例正常脑组织DNA，检测MAGE-D4启动子区域CpG位点甲基化水平。 3.荧光素酶报告基因质粒构建:根据生物信息学分析结果，构建5个不同截短MAGE-D4启动子荧光素酶报告基因载体(pGL3-P1～P5)。 4.荧光素酶活性检测(Luciferase assay):将构建好的pGL3-P1～P5转染细胞，检测荧光素酶活性，筛选MAGE-D4核心启动子区域;用已筛选出的pGL3-p进行后续相关实验。 5.实时荧光定量PCR(qRT-PCR):提取细胞总RNA，将RNA逆转录为cDNA，cDNA经管家基因扩增检测质量后，用于检测Sp1mRNA和MAGE-D4mRNA。 6.蛋白质印迹法(Western Blot):提取细胞核蛋白，用于检测Sp1蛋白表达。 7.染色质免疫共沉淀-qPCR(ChIP-qPCR):Sp1抗体富集DNA/Sp1蛋白复合物，然后qRT-PCR扩增，检测Sp1与MAGE-D4启动子的结合。 结果: 1.生物信息学分析显示，MAGE-D4启动子序列具有Sp1等多个转录因子结合位点，其相对核心启动子区域含4个Sp1潜在结合位点并与甲基化位点重合;胶质瘤中MAGE-D4和Sp1表达较高，正常组织中表达较低，二者具有一定的共表达相关性。 2.MAGE-D4核心启动子区域的确定:通过构建5个不同截短MAGE-D4启动子报告基因载体，进行荧光素酶报告基因载体活性检测，筛选出-358～+172bp区域为MAGE-D4基因的相对核心启动子。 3.质谱分析结果显示，胶质瘤样本中MAGE-D4启动子区域平均总体甲基化频率低于正常脑组织样本。 4.Luciferase assay结果显示，启动子甲基化降低MAGE-D4启动子活性。 5.Luciferase assay和qRT-PCR结果显示，Sp1能够增强MAGE-D4启动子活性并促进MAGE-D4转录。 6.ChIP-qPCR证实Sp1直接结合于MAGE-D4启动子区域;DAC处理胶质瘤细胞株后，能提高Sp1与MAGE-D4启动子的结合能力。 7.Luciferase assay结果显示，非甲基化的MAGE-D4启动子，再转染pcDNA-Sp1，报告基因载体显示出相对最高的启动子活性，提示Sp1和去甲基化存在协同作用共同提高了MAGE-D4启动子活性。 结论: 1.MAGE-D4相对核心启动子区域为-358～+172bp; 2.MAGE-D4启动子活性与其甲基化状态有关; 3.转录因子Sp1能活化MAGE-D4启动子并促进其转录; 4.去甲基化和Sp1协同提高MAGE-D4启动子活性。