沉默GOLPH3对肝细胞癌化疗敏感性影响的体内外实验研究

摘要

目的:肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是我国发生率与死亡率最高的恶性肿瘤之一;部分HCC患者在就诊时往往已属晚期，失去手术治疗机会，且容易发生侵袭与转移，预后较差。肝细胞癌对化疗药物不敏感一直是治疗肝细胞癌的难点。高尔基体磷蛋白3(Golgi phosphoprotein3，GOLPH3)主要定位在高尔基体外侧网络(TGN)，在细胞生理中起着重要的作用，主要在高尔基形态维持、囊泡运输、蛋白糖基化、受体分配、线粒体功能等五个方面发挥作用。GOLPH3作为一种新的癌基因，由Kenneth L.Scott基于对人类癌症的全基因组拷贝数的分析，发现5p13位点在多种类型的实体肿瘤，如肺癌，卵巢癌，乳腺癌，前列腺癌和黑色素瘤中，呈现明显的扩增趋势。有研究报道肿瘤组织中GOLPH3高表达可以提高以5-Fu为基础辅助化疗的结直肠癌患者的预后效果，增加结直肠癌细胞中GOLPH3的表达也可以提高肿瘤细胞对5-Fu化疗药物的敏感性。但值得注意的是，有报道沉默口腔鳞状细胞癌细胞GOLPH3表达可通过调节Caspase-3，Bcl-2和cytochrome-c的表达来提高化疗效果
　　方法:应用RT-PCR和Western blot技术检测8株肝细胞癌细胞系(Huh7、BEL-7402、HCCLM3、HepG2、SMMC-7721、SKHEP1、MHCC97H、MHCC97L)和一株正常肝细胞细胞系（HL-7702）中GOLPH3在mRNA及蛋白水平的表达情况。选择GOLPH3相对高表达细胞系，使用siRNA构建干扰的GOLPH3肝细胞癌细胞系，通过AnnexinⅤ-PI染色法，流式细胞仪检测5-FU，ADM， Cyclophosphamide，OXA对肝细胞癌细胞化疗药物敏感性的影响。使用慢病毒感染的方式构建稳定的GOLPH3干扰的huh7细胞系，通过裸鼠体内体内成瘤实验，检测GOLPH3在体内环境下对肿瘤生长及化疗药物敏感性的影响。筛查与细胞凋亡相关的基因，探究GOLPH3影响肝细胞癌化疗敏感性可能的分子机制。
　　结果:通过RT-PCR和Western blot技术检测8株肝细胞癌细胞系(Huh7、BEL-7402、HCCLM3、HepG2、SMMC-7721、SKHEP1、MHCC97H、MHCC97L)中GOLPH3的mRNA及蛋白表达水平结果明显高于正常肝细胞细胞系(HL-7702)，其中huh7和SMMC-7721呈现相对高表达。使用siRNA沉默huh7和SMMC-7721的GOLPH3表达，流式细胞仪结果显示GOLPH3干扰组应用5-FU，ADM，Cyclophosphamide，OXA后，其凋亡比例明显高于对照组(P＜0.05)，两组细胞凋亡能力差异具有统计学意义。使用慢病毒感染的方式构建稳定的GOLPH3干扰的huh7细胞系后，通过裸鼠体内成瘤发现，干扰GOLPH3组，肝细胞癌体内成瘤速度明显低于正常对照组，且使用化疗药物阿霉素后，干扰GOLPH3组的肿瘤抑制作用明显强于对照组。
　　结论:干扰GOLPH3可增加5-FU、OXA、ADM、Cyclophosphamide等化疗药物所致肝细胞癌细胞的凋亡;裸鼠体内研究证实干扰GOLPH3可抑制肿瘤生长，并可以增加化疗药物对肿瘤生长的抑制作用。

目录

声明

摘要

英文缩略语

1 前言

2．1 材料

2．1．1 研究对象

2．1．2 主要材料

2．1．3 主要仪器

2．2 方法

2．2．1 细胞系的培养

2．2．2 RT-PCR检测GOLPH3基因的表达

2．2．3 Western Blot检测GOLPH3的表达

2．2．4 建立干扰细胞系并验证

2．2．5 流式细胞仪检测化疗药物对细胞凋亡的影响

2．2．6 阿霉素对GOLPH3沉默后Huh-7细胞裸鼠体内成瘤的影响

2．2．7 统计学处理

3 结果

3．1 GOLPH3在肝细胞癌细胞系和正常肝细胞系中的表达

3．1．2 Western Blot检测肝细胞癌细胞系和正常肝细胞系GOLPH3在蛋白水平的表达情况

3．2 流式细胞仪检测干扰GOLPH3后对化疗药物对细胞凋亡的影响

3．3 慢病毒建立建立GOLPH3干扰细胞系并验证

3．4 阿霉素对GOLPH3沉默后Huh-7细胞裸鼠体内成瘤的作用

4 讨论

5 结论

参考文献

综述 Go1ph3研究进展简介

致谢

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