CREB1上调野生型BRAF基因表达在子宫内膜异位症发生发展中的作用及机制研究

摘要

目的：子宫内膜异位症（内异症，Endometriosis）是一种常见的具有雌激素依赖性的慢性妇科病及难治病。其主要临床特征是盆腔包块、痛经为典型特点的慢性盆腔痛和不孕等，并具有类似恶性肿瘤的广泛种植及侵袭生长能力的生物学行为，其发病机制仍不清楚。越来越多的证据表明子宫内膜异位症在位内膜尤其是分泌期在位内膜异常的分子改变可以促进子宫内膜异位症的发展，因此对分泌期在位内膜特异基因及其相关分子机制的探讨可为子宫内膜异位症的发病机制提供新的理论依据。BRAF基因全名为鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌基因同源体B1(v-rafmurine sarcoma viral oncogene homologB1)，属于RAS—RAF—MEK—ERK信号通路中的一员，该通路是一个重要的细胞功能通路，研究表明该通路参与子宫内膜异位症的发生发展。BRAF基因包括野生型(wtBRAF)及突变型(mutBRAF)，多数与恶性肿瘤相关的BRAF基因以突变型为主。另有研究发现，wtBRAF基因及蛋白过表达可以激活ras-b-raf-mapk信号通路。课题组前期研究发现与正常子宫内膜相比，子宫内膜异位症患者在位内膜BRAF基因mRNA及蛋白相对表达量明显增高，提示BRAF基因可能参与子宫内膜异位症的发生发展，然而在子宫内膜异位症中是否存在BRAF基因点突变以及wtBRAF基因过表达的转录调控机制仍是不明确的。CREB1(cAMP responsive element binding protein1)是研究较透彻的转录因子，属于bZIP家族，能增强其靶基因的表达促进细胞的增殖和分化。研究表明，CREB1在促进肿瘤细胞生长增殖中发挥着重要作用，具有癌基因的功能，参与多种基因的转录调控。本课题组前期对子宫内膜异位症患者在位内膜与正常子宫内膜组织进行IncRNA芯片筛查，结果发现在位内膜中CREB1 mRNA的相对表达水平明显高于正常子宫内膜。然而CREB1在子宫内膜异位症患者异位内膜和在位内膜中的表达情况及其是否对wtBRAF基因表达具有调控作用却是未知的。
　　方法：选择行全子宫切除术的子宫内膜异位症患者30例为实验组，根据月经周期及病理验证，留取分泌期在位内膜，同时留取异位病灶。对照组为同期排除雌激素依赖性疾病患者的正常子宫内膜。所有患者均月经规律，无其他恶性疾病、雌激素依赖性疾病、免疫性疾病、外科疾病及炎症疾病。术前6个月内未接受GnRH类似物、激素类及抗炎药物治疗。利用Sanger测序检测子宫内膜异位症患者异位内膜和在位内膜及正常子宫内膜中BRAF基因第11及15外显子突变情况。利用NCBI、UCSC、JASPAR、TRANSFAC等数据库预测能够与wtBRAF启动子上游2000 bp区域内结合的转录因子。利用实时荧光定量PCR技术、免疫组化及蛋白免疫印迹方法检测子宫内膜异位症患者异位内膜和在位内膜及正常子宫内膜中wtBRAF与CREB1 mRNA和蛋白的表达情况并进行相关性分析。原代培养子宫内膜间质细胞，利用实时荧光定量PCR技术、蛋白免疫印迹技术检测wtBRAF、CREB1 mRNA和蛋白在子宫内膜异位症患者在位内膜及正常子宫内膜间质细胞中的表达。子宫内膜异位症患者在位内膜间质细胞分别沉默wtBRAF、CREB1，正常子宫内膜间质细胞分别过表达wtBRAF、CREB1，蛋白免疫印迹检测转染前后子宫内膜异位症患者在位内膜及正常子宫内膜间质细胞中wtBRAF及CREB1蛋白表达水平的改变。CCK-8细胞增殖实验检测wtBRAF及CREB1表达改变前后细胞增殖能力的改变。划痕实验检测wtBRAF及CREB1表达改变前后细胞迁移能力的改变，Transwell细胞侵袭实验检测wtBRAF及CREB1表达改变前后细胞侵袭能力的改变。双荧光素酶报告实验检测CREB1过表达后wtBRAF基因启动子荧光素酶活性改变。染色质免疫共沉淀技术检测CREB1与wtBRAF启动子结合情况。实时荧光定量PCR技术、蛋白免疫印迹检测转染CREB1前后wtBRAF mRNA和蛋白表达情况，蛋白免疫印迹检测wtBRAF表达改变前后CyclinD1、ERK及p-ERK表达情况。
　　结果：⑴Sanger测序筛查报告显示30例子宫内膜异位症患者异位及在位内膜标本中未检测到BRAF基因第11及15外显子点突变的存在，均为野生型。接着我们利用种属为人的JASPAR核心转录因子数据库预测能够与wtBRAF启动子上游2000bp区域内结合的转录因子，结果显示共有323个（相关系数默认为80％)，其中相对评分大于1.000的基因为5个，分别是CREB1(cAMP responsiveelement binding protein1;NCBI Gene ID1385), SPIB(Spi-B transcription factor;NCBI Gene ID6689), NFATC2(nuclear factor of activated T-cells2;NCBI Gene ID4773), ZNF354C(zinc finger protein354C; NCBI Gene ID30832), and SOX10(SRY-box10; NCBI Gene ID6663)。同时结合TRANSFAC数据库与JASPAR数据库预测到CRE序列位点(TGACGTCA)位于wtBRAF转录起始位点上游（-266～-259 bp）。实时荧光定量PCR技术结果提示子宫内膜异位症患者在位内膜中wttBRAF、CREB1 mRNA相对表达量显高于正常子宫内膜(P＜0.001)，而异位内膜和在位内膜两组之间差异无统计学意义(P＞0.05)。免疫组化结果提示wtBRAF蛋白定位表达于上皮及间质细胞的细胞质，而CREB1蛋白定位表达于上皮及间质细胞的细胞核。正常内膜组织中wtBRAF、CREB1蛋白表达的阳性率为24.0％、36.0％，子宫内膜异位症患者在位内膜组织中wtBRAF、CREB1蛋白阳性分别率为70.0％、80.0％，而同期的子宫内膜异位症患者异位内膜组织中CREB1蛋白阳性率分别为63.3％、76.0％。该结果表明，子宫内膜异位症患者在位内膜中wtBRAF、CREB1蛋白的阳性表达率和表达强度均明显高于正常内膜(P＜0.05)，而异位内膜和在位内膜两组之间差异无统计学意义(P＞0.05)。蛋白免疫印迹方法检测结果提示子宫内膜异位症患者在位内膜中wtBRAF、CREB1蛋白相对表达量明显高于正常内膜(P＜0.05)，而异位内膜和在位内膜两组之间差异无统计学意义(P＞0.05)。且通过Pearson's相关性分析发现CREB1蛋白表达水平与wtBRAF mRNA(R=0.417，P＜0.001)及蛋白(R=0.529，P＜0.001)表达水平均存在正相关。⑵实时荧光定量PCR技术及蛋白免疫印迹结果提示子宫内膜异位症患者在位内膜间质细胞wtBRAF及CREB1 mRNA及蛋白表达水平较对照组正常子宫内膜间质细胞显著增高。在子宫内膜异位症患者在位内膜间质细胞中分别沉默wtBRAF基因及CREB1基因，细胞的增殖及迁移侵袭能力明显减弱，而在正常子宫内膜间质细胞中分别过表达wtBRAF基因及CREB1基因，细胞的增殖及迁移侵袭能力明显增强。⑶Pearson's相关性分析发现子宫内膜异位症患者在位内膜与正常子宫内膜间质细胞中CREB1蛋白表达水平与wtBRAF mRNA(R=0.609，P＜0.01)及蛋白(R=0.644，P＜0.01)表达水平均存在正相关。荧光素酶报告基因结果显示wtBRAF启动子和CREB1 cDNA共转染组与阴性对照组相比，荧光素酶活性明显升高。染色质免疫共沉淀结果提示与CREB1结合的DNA片段中存在wtBRAF基因的启动子序列。⑷子宫内膜异位症患者在位内膜间质细胞沉默CREB1基因后wtBRAF mRNA及蛋白表达水平明显降低。在正常子宫内膜间质细胞中过表达CREB1基因后wtBRAF mRNA及蛋白表达水平明显升高。在子宫内膜异位症患者在位内膜间质细胞中沉默wtBRAF基因，CyclinD1表达明显下降，磷酸化ERK的表达明显降低，总ERK表达水平未见明显改变;在正常子宫内膜间质细胞中过表达wtBRAF基因Cyclin D1表达明显升高，磷酸化ERK的表达明显升高，总ERK表达水平未见明显改变。
　　结论：①BRAF基因第11及15外显子点突变可能不参与子宫内膜异位症的发生发展，wtBRAF基因与CREB1基因在子宫内膜异位症患者异位和在位内膜组织的异常表达可能参与子宫内膜异位症的发生。②wtBRAF及CREB1基因过表达可以促进在位内膜间质细胞增殖、迁移及侵袭。③CREB1上调内异症分泌期在位内膜wtBRAF基因促进其蛋白表达，进一步激活wtBRAF介导的RAS-RAF-MEK-ERK信号通路，从而影响在位内膜间质细胞的生物学行为。

目录

声明

摘要

英文缩略语

第一部分：子宫内膜异位症BRAF基因突变筛查及野生型BRAF与CREB1基因表达的相关性分析

1 前言

2．1 主要试剂和仪器

2．2 研究对象及分组

2．3 研究方法

2．4 统计学处理

3 结果

3．1 BRAF第11和15外显子突变检测结果

3．2 BRAF基因启动子区转录因子预测

3．3 子宫内膜异位症患者异位及在位内膜中wtBRAF、CREB1 mRNA表达情况

3．4 子宫内膜异位症患者异位及在位内膜中wtBRAF、CREB1蛋白表达情况

3．5 子宫内膜组织中CREB1与wtBRAF表达的相关性分析

4 讨论

结论

第二部分： CREB1基因上调wtBRAF基因表达促进子宫内膜异位症在位内膜间质细胞增殖、迁移侵袭

5 前言

6．1 主要试剂和仪器

6．2 研究对象及分组

6．3 研究方法

6．4 统计学处理

7．1 子宫内膜间质细胞鉴定

7．2 子宫内膜间质细胞中BRAF及CREB1的表达情况

7．3 wtBRAF1对子宫内膜间质细胞生物学功能的影响

7．4 CREB1基因对子宫内膜间质细胞生物学功能的影响

7．5 CREB1基因对wtBRAF基因表达的调控作用

7．6 CREB1基因调控wtBRAF启动RAS-RAF-MEK-ERK通路作用

8 讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 BRAF基因与肿瘤关系的研究进展

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

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