动态压力诱导多孔超弹性钛金属支架中骨髓间充质干细胞增殖和成骨性的研究

摘要

目的:多孔超弹性钛金属支架作为一种新型的组织工程学支架，其不同的孔隙率对于种植在其上的细胞的增殖、分化能力是不同的，并且受到压应力时会进一步增强细胞的增殖分化能力。本文选用目前无人研究的新型支架。该支架具有低弹性模量的超弹性结构。我们的研究试图研究随着多孔超弹性支架的孔隙率及其细胞-支架复合物整体受到的周期性压应力不同，对种植于支架上的细胞的生长、增殖、分化能力的影响进行探究，并且找出最适合细胞增殖和分化的孔隙率及其周期性压应力。
　　方法:1、本文选用使用绿色荧光标记的大鼠骨髓间充质干细胞(RASMX-GFP)，进行大鼠骨髓间充质干细胞转化成骨细胞的诱导，通过进行定期观察，茜素红染色，western bolt检测runx2进行诱导结果的评价。2、将骨髓间充质干细胞种植于多孔超弹性钛金属支架上，选用多孔超弹性钛金属支架的孔隙率分别为65％，75％，85％.不同孔隙率的多孔超弹性钛支架经过细胞种植之后放在Bose生物体外压力反应器中进行加压处理，按组给予不同的压力处理，分为0N，30N，50N，80N4种压力组，实验共12个实验组:0N65％组;0N75％组;0N85％组;30N65％组;30N75％组;30N85％组;50N65％组;50N75％组;50N85％组;80N65％组;80N75％组;80N85％组。3、使用MTS方法及总蛋白检测法检测细胞增殖能力，使用MTS法绘制细胞支架上细胞的细胞增殖曲线。4、对细胞-支架复合体进行电镜扫描，检测细胞在支架上的细胞伸展情况，观测各支架整体细胞分布5、使用荧光照相显示各组支架上细胞的增殖和分布情况。6、使用茜素红染色显示细胞-支架复合物整体的钙化结节分布情况，再从细胞层次对各组细胞的钙化结节染色情况进行观察。7、使用偶氮偶联法进行碱性磷酸酶染色显示各组细胞的ALP活性，观察其成骨性。并且使用碱性磷酸酶检测法对各组的ALP活性进行定量分析。8、Western bolt实验检测各组RUNX2水平，从蛋白水平证明各组细胞在不同的条件时的成骨分化能力。9、各组细胞进行RT-PCR检测，针对RUNX2，BMP-2，ALP三种成骨特异表达RNA进行检测，从RNA水平对各组细胞的成骨性进行检测。每项实验进行3次重复以减少误差。
　　结果:1、骨髓间充质干细胞培养一天，细胞贴壁培养，密集生长，呈长梭形。随着诱导时间的增加可见细胞的形态从长梭形变成了多边形。14天开始细胞堆积形成了钙化结节，第21天进行茜素红染色可见明显的钙化结节呈橘红色。2、细胞在支架上种植情况良好，进行体外不同压力周期性压力加压。3、随着给予细胞压力的升高细胞的增殖能力会升高，但随着压力逐渐增大，细胞增殖能力的增大逐渐趋于平缓。同时随着孔隙率的增大，细胞增殖能力会升高，但是75％和85％孔隙率组的细胞增殖能力相差不是很大，证明随着孔隙率逐渐增大，细胞增殖能力的增加也逐渐趋于平缓。4、在电镜下发现各组细胞伸展情况良好，随着孔隙率的增大，细胞的分布更加密集5、在荧光倒置相差显微镜下观察，孔隙率及施加压力越大，细胞分布越密。6、对各组细胞支架复合物整体茜素红染色可以看出各组支架上钙化结节的分布范围，与支架的孔隙率为正相关。从细胞层次对各组进行对比。可以看见钙化结节的数量和大小与细胞受到的压力和孔隙率成正相关。7、通过染色估计碱性磷酸酶阳性细胞率，结果显示随压力的升高，碱性磷酸酶活动区域越大。随着孔隙率越高，碱性磷酸酶活性越高。使用碱性磷酸酶活性检测进行定量分析结果与染色结果相一致。8、通过westernbolt灰度对比从蛋白水平可以看出随着孔隙率和给予的动态压力的提高，其第14天细胞内RUNX2含量会相应提高。9、以从RUNX2，BMP-2，ALP三种成骨特异表达的RT-PCR看出其细胞支架复合体上细胞的成骨基因表达差异会随着细胞-支架复合体受到的压力的增加而增加，同时也随着支架孔隙率的增加而增加，从RNA水平论证了上述实验的结论。
　　结论:实验表明给予细胞周期性的压应力可以促进细胞的增殖和分化。对于细胞增殖能力来说，压力增加到一定程度(80N)，细胞的增殖能力也会趋于平缓。并且孔隙率增加到一定水平(85％)。细胞的增殖能力也会趋于平缓，证明随着压力和孔隙率不同造成的形变对于增殖能力的影响是有一定的范围的。从多个实验可以表明，细胞的成骨性与细胞所受到的周期性压力及其支架的孔隙率呈正相关，随着孔隙率及受到的周期性压应力的增大，细胞的成骨分化能力会持续增大。

目录

声明

摘要

英文缩略语

1 前言

2．1．1 实验细胞

2．1．2 试剂和材料

2．1．3 仪器设备

2．2 实验方法

2．2．1 多孔超弹性钛金属支架的选择

2．2．2 各实验组形变情况检测

2．2．3 骨髓间充质千细胞培养

2．2．4 成骨细胞的诱导与鉴定

2．2．5 细胞-支架复合体的构建与加压培养

2．2．6 MTS方法及总蛋白监测法测量细胞增殖能力

2．2．7 细胞-支架复合体的电镜扫描

2．2．8 荧光照相显示支架上细胞的增殖和分布

2．2．9 茜素红染色显示钙化结节

2．2．10 碱性磷酸酶染色及碱性磷酸酶检测显示其成骨性

2．2．11 Western bolt实验检测各组RUNX2表达水平

2．2．12 RT-POR检测

2．2．12 统计学方法

3 结果

3．1 多孔超弹性超弹性钛金属支架弹性模量检验

3．2 细胞形态学观察

3．3 成骨细胞的诱导和鉴定

3．4 细胞-支架复合体的联合加压培养

3．5 MTS法及BOA法检测细胞增殖能力

3．6 细胞-支架复合体的电镜扫描结果

3．7 荧光照相结果

3．8 茜素红染色结果

3．9 碱性磷酸酶染色结果

3．10 western bolt检查结果

3．11 PCR检验结果

4 讨论

5 结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 多孔钛合金-BMSCs支架作为组织工程学支架用于骨缺损的研究现状

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

个人简历