CNI类免疫抑制剂对INS1细胞内hIAPP沉积的影响及其与细胞功能相关性的研究

摘要

背景:在接受器官移植后CNI免疫抑制剂的长期使用的过程中，研究人员发现糖尿病的发生十分普遍，而关于CNI免疫抑制剂所引起的糖尿病的发生率，又有诸多文献报道他克莫司（FK506）造成的糖尿病的发生率要远高于环孢霉素A(CsA)，虽然关于此种现象的报道十分普遍，但造成此种现象的机制报道十分少见，目前仍然十分不清楚为何会出现这种现象。糖尿病分为1型糖尿病和2型糖尿病，两种糖尿病都是威胁人类健康的重大慢性非传染性疾病之一。预计到2030年，我国糖尿病新发病例将增加到1.297亿，占总人口的12.1％。鉴于其发病率的迅猛提高和其对社会所造成的严重危害与医疗资源的消耗，糖尿病已然成为了我国面临的最为突出的公共卫生问题之一。由于目前对糖尿病的治疗方法十分有限，绝大多数2型糖尿病主要依靠药物治疗，而治疗1型糖尿病和少部分2型糖尿病主要方法为胰岛移植或胰岛素替代治疗，但胰岛素替代治疗存在无法避免糖尿病并发症的发生等问题，同时也不能完全模拟胰岛素生理模式的分泌。因此胰岛移植成为了最具前景的取代胰岛素替代治疗的方式之一，然而移植物长期存活率低仍是阻碍胰岛移植发展的主要障碍。诸多学者在研究胰岛移植物失去功能时，通过对因意外死亡的接受胰腺移植或胰岛移植的。受者中的移植胰岛的检查发现，和2型糖尿病患者惊人的相似，都出现了人胰岛淀粉样多肽(human isletamyloid polypeptide，hIAPP)沉积。hIAPP是一种胰岛β细胞内形成并且与胰岛素按照一定比例相伴分泌的一种激素，其本身具有调节糖代谢的生理作用。然而，hIAPP因其本身的自身结构特点，导致其具有极强的错误折叠倾向，而这种错误折叠一旦形成，将在胰岛β细胞内外形成沉积，进而对β细胞的功能造成时间依赖性的严重损害。正因如此，关于hIAPP错误折叠的研究已成为国内外学者研究2型糖尿病发病机制和胰岛移植后移植物失活的热点机制之一。因此我们推测，hIAPP错误折叠也是导致CNI类免疫抑制剂使用后所致的糖尿病的重要原因之一。然而，目前关于胰岛移植后hIAPP沉积的机制研究主要集中于非免疫因素方面，而关于CNI类免疫抑制剂是否会引起hIAPP沉积增加的研究目前尚无任何报道，因此，本研究希望通过hIAPP-INS1细胞模型的建立，验证CNI类免疫抑制剂与hIAPP沉积的关系，从一个全新的角度阐明CNI免疫抑制对胰岛β细胞的毒性作用机制，同时阐明CNI类免疫抑制剂促进hIAPP沉积形成的分子机制，为使用CNI后的糖尿病及胰岛移植物失功的防治提供一个新的思路。
　　方法:1、通过慢病毒稳定转染大鼠胰岛素瘤细胞系INS1，建立具有puromycin抗性的新型细胞系，并经过嘌呤霉素2μg/ml筛选10天，筛选出过表达hIAPP的稳转细胞株hIAPP-INS1以及仅带有对照组细胞株CON-INS1;通过qRT-PCR方法检测hIAPP基因在hIAPP-INS1细胞以及CON-INS1细胞中的表达情况;利用荧光显微镜检测硫代硫黄素S染色后hIAPP-INS1细胞以及CON-INS1细胞中hIAPP沉积量;利用化学发光仪检测硫代硫黄素S染色后hIAPP-INS1细胞以及CON-INS1细胞中hIAPP表达所造成的荧光强度;通过ELISA法测定hIAPP-INS1细胞以及CON-INS1细胞在不同浓度的葡萄糖刺激下(2mM葡萄糖、20mM葡萄糖)的葡萄糖刺激胰岛素分泌能力。
　　2、利用已经构建成功的CON-INS1细胞和hIAPP-INS1细胞，使用不同浓度的他克莫司（0，5，10，15，20，25μg/L）和环孢霉素A（0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5μg/ml）对其培养;通过MTS法检测不同浓度的他克莫司和环孢霉素A对CON-INS1细胞和hIAPP-INS1细胞增殖活性的关系;通过qRT-PCR方法检测不同浓度的他克莫司和环孢霉素A对hIAPP-INS1细胞中的表达情况的影响;利用荧光显微镜检测硫代硫黄素S染色后不同浓度的他克莫司和环孢霉素A对hIAPP-INS1细胞中的表达情况的影响;利用化学发光仪检测硫代硫黄素S染色后不同浓度的他克莫司和环孢霉素A对hIAPP-INS1细胞中的hIAPP表达所造成的荧光强度的影响;通过ELISA法测定不同浓度的他克莫司和环孢霉素A下hIAPP-INS1细胞在不同浓度的葡萄糖刺激下(2mM葡萄糖、20mM葡萄糖)的葡萄糖刺激胰岛素分泌能力的影响。
　　3、利用已经构建成功的CON-INS1细胞和hIAPP-INS1细胞，使用他克莫司对其培养;通过Weste n blot方法检测他克莫司对JAK2/Foxa2/hIAPP分子信号通路的影响。
　　4、利用20μM的白藜芦醇对hIAPP-INS1细胞进行培养，观察hIAPP沉积降解情况，及GSIS变化。
　　结果:1、过表达hIAPP的大鼠胰岛素瘤细胞INS1的细胞模型的建立及其模型鉴定的研究中:(1) hIAPP-INS1细胞系中的hIAPP表达情况显著上调;(2)hIAPP-INS1细胞与CON-INS1细胞相比，其荧光强度显著增强;(3) hIAPP-INS1细胞与CON-INS1细胞相比，其葡萄糖刺激胰岛素分泌能力显著下降。
　　2、CNI类免疫抑制剂对过表达hIAPP的大鼠胰岛素瘤细胞INS1的细胞模型中hIAPP沉积及其细胞功能的影响研究中:(1)随着他克莫司使用浓度的增高，CON-INS1细胞和hIAPP-INS1细胞之间的增殖活性呈现显著差异，而在使用环孢霉素A时，在任何浓度下CON-INS1细胞和hIAPP-INS1细胞之间都不存在增殖活性差异;(2)随着他克莫司浓度增大，hIAPP-INS1细胞中绿色荧光逐渐加重，但不同浓度的环孢霉素A未见明显变化趋势;(3)随着他克莫司浓度增大，各组hIAPP-INS1细胞中hIAPP的mRNA表达量逐渐上调，但不同浓度的环孢霉素A药物作用后未见明显变化趋势;(4)他克莫司作用下，hIAPP-INS1细胞和CON-INS1细胞相比，其葡萄糖刺激胰岛素分泌能力下降趋势十分明显，但不同浓度的环孢霉素A药物作用后hIAPP-INS1细胞和CON-INS1细胞相比，其葡萄糖刺激胰岛素分泌能力没有下降趋势。
　　3、他克莫司通过刺激细胞内Foxa2过表达进而促进hIAPP沉积研究中，他克莫司通过增加转录因子Foxa2表达增加hIAPP的转录与沉积。
　　4、白藜芦醇可以降解细胞内hIAPP沉积保护胰岛β细胞功能。
　　结论:hIAPP-INS1细胞模型与CON-INS1细胞模型成功建立;hIAPP-INS1细胞模型的葡萄糖刺激胰岛素分泌功能受到较为明显的抑制;他克莫司对hIAPP-INS1细胞的增殖活性较环孢霉素A影响更大;他克莫司可以增加hIAPP-INS1细胞模型中hIAPP沉积量，环孢霉素A无此作用;他克莫司对hIAPP-INS1细胞的葡萄糖刺激胰岛素分泌能力影响较环孢霉素A更大;他克莫司具有通过JAK2/Foxa2/hIAPP信号通路增加hIAPP-INS1细胞中hIAPP沉积的作用;白藜芦醇可以通过降解hIAPP沉积保护FK506对hIAPP-INS1细胞的损伤作用。

目录

声明

摘要

英文缩略语

前言

第一部分：FK506及CsA对hIAPP沉积及INS1细胞功能的影响

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

2．1 稳定转染过表达hIAPP的慢病毒进而建立大鼠胰岛素瘤细胞系hIAPP-INS1

2．2 qRT-PCR方法对比CON-INS1细胞及hIAPP-INS1细胞中hIAPP表达情况

2．3 酶联免疫吸附法检验INS1细胞、CON-INS1细胞及hIAPP-INS1细胞葡萄糖刺激胰岛素分泌能力的变化

2．4 CNI类免疫抑制剂对CON-INS1细胞和hIAPP-INS1细胞增殖活性的影响

2．5 不同浓度CNI类免疫抑制剂对hIAPP沉积的影响

2．6 化学发光仪检测不同浓度CNI类免疫抑制剂造成hIAPP沉积荧光强度变化

2．7 不同浓度CNI类免疫抑制剂对hIAPP的mRNA表达量的影响

2．8 不同浓度CNI类免疫抑制剂对CON-INS1细胞和hIAPP-INS1细胞葡萄糖刺激胰岛素分泌能力的影响

3 结论

第二部分：FKS06增加INS1细胞内hIAPP过表达的分子机制研究

4．1 材料

4．2 方法

5 结果

5．1 他克莫司通过增加转录因子Foxa2表达增加hIAPP的转录

6 结论

第三部分：白藜芦醇通过提高INS1细胞自噬能力降解FK506导致的hIAPP沉积的研究

7．1 材料

7．2 方法

8 结果

8．1 白藜芦醇降解FK506导致的hIAPP沉积

8．2 白藜芦醇恢复FKS06导致的INS1细胞GSIS

9 结论

讨论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 人胰岛淀粉样多肽代谢方式与异常聚集的研究进展

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

个人简介