miR-150下调AKT3抑制膀胱癌增殖、侵袭作用的研究

摘要

目的:探讨miR-150对靶基因AKT3的调控作用及其在膀胱癌中的具体作用
　　研究方法:调取2014年9月-2015年10月中国医科大学附属第一医院泌尿外科60例膀胱癌患者标本及其中20例癌旁组织标本，并详细记录标本相关临床病历资料。通过qRT-PCR（Quantitative real-time polymerase chain reaction）重复检测膀胱癌组织及癌旁组织间miR-150并初步判断miR-150在两种组织中有无差异。然后用TargetScan预测miR-150下游靶基因，选取AKT3进一步研究，用qRT-PCR检测膀胱癌组织及癌旁组织间AKT3的表达，并结合患者性别、年龄、肿瘤部位、T分期、分化程度及淋巴转移等情况进行统计学分析。通过脂质体转染人工合成的miR-150激动剂(agomir)、抑制剂(antagomir)，转染至膀胱癌细胞，根据转染条件转agomir的为5637/T24 agomir组并以Negativecontrol(NC)作为对照，转antagomir的为5637/T24 antagomir组并以Anti-Negative control(Anti-NC)作为对照。转染后PCR确定转染效率，然后用转染成功的细胞进行CCK8(Cell Counting Kit-8)细胞增殖实验、Western Blot实验、Transwell实验。用基因工程方法构建双荧光素酶表达载体，包括AKT3野生型载体和突变型载体，转染后进行双荧光素酶报告基因实验(Dual-LuciferaseReporter Assay)。在5637和T24中通过脂质体转染人工合成的AKT3-SiRNA，转染后PCR和Western Blot检测转染效率。然后我们用转染成功的细胞进行CCK8细胞增殖实验、Western Blot实验、Transwell实验。
　　结果:60例膀胱癌标本和20例癌旁膀胱上皮组织标本的PCR结果显示:膀胱癌组织中miR-150的表达量显著低于癌旁组织(P=0.0167)，而相对于癌旁膀胱上皮组织AKT3表达量在膀胱癌组织中更高。另外我们发现TNM＜2的膀胱癌标本中miR-150的表达量明显高于TNM≥2的膀胱癌标本(P=0.0219)。膀胱癌组织中miR-150的相对表达量与AKT3的相对表达量呈现明显的负相关性(r=-0.4159)。而且在未发生转移的膀胱癌标本中miR-150的表达量高于已有淋巴结转移或远隔转移的膀胱癌标本，差异具有统计学意义。miR-150在正常膀胱上皮细胞系SV-HUC-1的表达量明显高于5637和T24，差异具有统计学意义(P＜0.05)。当我们在5637和T24中转染miR-150的agomir并以NC为对照时，CCK8细胞增殖实验显示实验组膀胱癌细胞的增殖速率明显下降，不铺基质胶和铺基质胶的Transwell实验都显示实验组穿过的膀胱癌细胞数明显减少。而当我们转染miR-150的antagomir并以Anti-NC为对照时CCK8细胞增殖实验和Transwell实验的结果则正好相反。在5637和T24中转染miR-150的agomir或antagomir并分别以NC和Anti-NC为对照，通过Western Blot实验我们发现与对照组相比agomir组的AKT3、N-cardherin表达降低而E-cardherin的表达升高，与之相反的是antagomir组的AKT3和N-cadherin表达升高而E-cadherin的表达降低。在293-T中过表达miR-150能够抑制AKT33'UTR载体荧光素酶活性，过表达miR-150后AKT33'UTR-WT荧光素酶活性的相对值降到45％。在膀胱癌细胞系5637和T24中转染AKT3的SiRNA和NC后，重复CCK8细胞增殖实验、Transwell实验和Western Blot实验我们发现结果与转染miR-150的agomir和NC后很相似。
　　结论:在膀胱癌组织和细胞中miR-150的表达量是下调的，且miR-150表达量在不同TNM分期的膀胱癌标本中具有显著差异性。膀胱癌组织中miR-150与AKT3表达量存在负相关调控的关系，且相对于癌旁膀胱上皮组织AKT3在膀胱癌组织中表达更高这暗示着AKT3可能是个癌基因。miR-150能抑制膀胱癌细胞的增殖、迁移侵袭能力。另外我们证实了AKT3是miR-150直接调控的靶基因。miR-150能通过调控EMT相关分子的表达抑制EMT进程，这是miR-150影响肿瘤侵袭转移的一种方式。而AKT3也能调控膀胱癌细胞的增殖、迁移侵袭能力，同时AKT3也能影响EMT相关分子的表达。终上所述，我们认为膀胱癌中miR-150通过调控AKT3的表达起到抑制肿瘤恶性生物学行为的作用。

目录

声明

摘要

英文缩略语

1 前言

2．1 标本

2．2 细胞株

2．3 主要试剂及溶液配制

2．4 实验仪器

2．5 实验仪器细胞培养，传代和冻存

2．6 细胞增殖实验

2．7 实时定量PCR

2．8 细胞转染siRNA／agomir／antagomir

2．9 Transwell细胞迁移侵袭实验

2．10 Westem Blot

2．11 靶基因的生物信息学预测、分析

2．12 Dual-luciferase reporter(双荧光素酶报告基因实验)

2．13 统计学分析

3 实验结果

3．1 miR-150在膀胱癌组织和细胞系中表达是下调的

3．3 在膀胱癌细胞系中转agomir和antagomir能显著调节miR-150的表达

3．4 miR-150能调控膀胱癌细胞的增殖能力

3．5 miR-150能调控膀胱癌细胞的迁移侵袭过程和EMT进程

3．6 miR-150能在mRNA和蛋白水平调控AKT3的表达

3．7 AKT3是miR-150直接作用的靶基因且二者在膀胱癌组织中存在负相关关系

3．8 通过AKT3的SiRNA敲除AKT3可以抑制膀胱癌细胞的增殖、迁移侵袭能力

4 讨论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 miRNAs对膀胱癌生物学行为的影响

致谢

个人简历