microRNA-320d下调靶基因CDK6抑制人弥漫大B细胞淋巴瘤细胞增殖、侵袭的作用机制的研究

摘要

目的： 探讨CDK6基因的表达与弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)临床病理特征之间的关系，验证hsa-microRNA-320d(miR-320d)靶向调控CDK6对DLBCL细胞增殖的影响及分子机制。 方法： (1)从被诊断为弥漫大B细胞淋巴瘤的病例中，我们收集库存于病理科档案室的患者石蜡样本84例，和详细的随访资料，同时采用免疫组化EnVision两步法对所收集的样本进行CDK6免疫标记同时验证其表达水平。 (2)利用三种生物信息学软件(miRDB，miRanda，Targetscan)预测与miR-320d的3’UTR端特异性结合的靶基因，萤火虫荧光素酶活性则采用双荧光素酶报告测定法去检测，同时验证靶基因CDK6的3’UTR和miR-320d的相互作用。 (3)在构建CDK6-shRNA的慢病毒载体的基础上选用成熟miRNA的慢病毒载体转染DLBCL细胞株。 (4)CCK-8法和Annexin V-APC/7-AAD法检测miR-320d稳定过表达和干扰CDK6对DLBCL细胞增殖和凋亡的影响。 (5)分别提取DLBCL组、miR-320d过表达组及对照组三组的总蛋白，同时采用Western blotting技术来检测CDK6蛋白的表达水平。 结果： (1)DLBCL患者组中CDK6基因的表达相较于滤泡性淋巴瘤(follicular lymphoma，FL)阴性对照组显著升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)。 (2)成功筛选并预测出 CDK6为 miR-320d的靶基因之一。CDK63’UTR与miR-320d的特异性结合通过双荧光素酶报告基因质粒转染后荧光素酶检测得以证实。 (3)敲低CDK6和miR-320d过表达的慢病毒载体被成功构建。相较于对照组，miR-320d过表达组DLBCL细胞增殖能力降低，CDK6敲低组DLBCL细胞增殖降低，这些均通过细胞增殖试验得以证实，同时差异具有统计学意义(P<0.05)。细胞凋亡试验尚未证实CDK6干扰组与miR-320d过表达组对DLBCL细胞凋亡率的影响是否有显著差异。 (4)采用DLBCL细胞株分别转染miR-320d过表达慢病毒载体与通用载体，并运用Western blotting法验证两者的数据结果。miR-320d过表达组中CDK6蛋白表达相对低于对照组(0.04±0.04/0.87±0.05)，差异具有统计学意义(P<0.05)。miR-320d可能影响和调控DLBCL细胞中CDK6基因的转录水平。 结论： CDK6蛋白在人DLBCL中高度表达，提示CDK6可能作为癌基因，成为导致DLBCL高致死率及预后欠佳的主要因素之一。miR-320d作用于基因的3’UTR，提示CDK6是miR-320d直接调控的靶基因；鉴于miR-320d对DLBCL细胞增殖能力可通过靶向调控CDK6来抑制的特性，可将CDK6视作判断DLBCL预后的潜在指标之一，同时CDK6也是DLBCL生物实验治疗的研究基础。