长链非编码RNA-CTD-2108O9.1、KRTAP5-AS1在胃癌中的作用与机制

摘要

目的:胃癌作为我国最常见的恶性肿瘤之一，具有症状隐匿，难以排查，死亡率高等特点。其中进展期胃癌患者的术后五年生存率长期徘徊在30％-50％。要从根本上提高胃癌的治疗效果，早期发现、早期诊断和早期治疗是关键所在。
　　长链非编码RNA(lncRNA)是一类不具备蛋白编码能力，长度大小在200-10000个核苷酸范围的RNA。有大量研究报道了长链非编码RNA与肿瘤的发生发展具有密切关系。然而，长链非编码RNA对于胃癌发生发展的影响及其机制的研究仍然存在许多不足。
　　前期，我们利用6对配对的胃癌与癌旁非癌组织应用“Array HumanMicroarray V2.0”进行芯片分析，检测lncRNA和mRNA的差异表达。我们发现lncRNA-CTD-2108O9.1，KRTAP5-AS1在胃癌组织与癌旁非癌组织中具有显著的差异表达。其中lncRNA-CTD-2108O9.1的长度为331个核苷酸，位于5号染色体，在胃癌组织中显著低表达。而lncRNA-KRTAP5-AS1位于第11号染色体，长度为2554个碱基，在胃癌组织中显著高表达，且进一步分析发现lncRNA-KRTAP5-AS1具有miR-596的结合位点。因此，基于芯片的结果，本研究首先在胃癌细胞系中验证了lncRNA-CTD-2108O9.1、KRTAP5-AS1的表达情况，并进一步探索lncRNA-CTD-2108O9.1以及lncRNA-KRTAP5-AS1在胃癌中可能发挥的功能及作用机制，最后在胃癌组织中检测两种lncRNA的表达情况，并分析其与临床病理资料以及预后的关系。
　　材料和方法:
　　1、细胞培养
　　人胃癌细胞系SGC-7901，BGC-823，HGC-27细胞以及人正常胃粘膜上皮细胞系GES-1均购自中科院上海细胞库。人胃癌细胞系AGS购自ATCC。SGC-7901，BGC-823，HGC-27细胞培养在含有10％胎牛血清的RPMI1640培养基（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）。AGS细胞培养在含10％胎牛血清的F-12培养基(Invitrogen)。GES-1细胞培养在含10％胎牛血清的DMEM培养基(Invitrogen)。所有细胞都置于37℃，5％CO2的孵箱中培养。
　　2、总RNA提取
　　应用Trizol提取总RNA。应用紫外分光光度计进行RNA浓度及纯度测定，检测结果应用A260/A280表示，结果大于1.9表示RNA纯度较好。
　　3、反转录反应
　　应用Takara反转录试剂盒，配置20μl反应体系（细胞）以及50μl反应体系（组织），经过37℃、30分钟，85℃、5秒进行反应，最终将总RNA反转录为cDNA。
　　4、 Real-time PCR反应
　　应用SYBR法在LightCycler480Ⅱ实时定量检测系统进行real-time PCR反应，结果以GAPDH作为内参，应用2-ΔΔCt法进行计算统计。
　　5、构建过表达载体
　　应用oligo法合成目的基因lncRNA-CTD-2108O9.1以及KRTAP5-AS1的基因序列，应用PCR技术对合成好的片段进行扩增，连接至pEX-2载体或pcDNA3.1中再进行感受态细胞转化。最终将质粒进行提取后测序，验证无误后进行质粒大提并保存
　　6、构建稳定表达细胞
　　使用lipo2000将过表达载体质粒转入胃癌细胞系SGC-7901，转染48小时后加入G418对稳定表达细胞进行筛选，以相同浓度持续筛选2周后，将单克隆细胞挑至96孔板继续培养。待细胞成系后应用荧光显微镜及real-time PCR对细胞系进行鉴定。
　　7、细胞增殖实验
　　细胞增殖实验采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法进行检测，于96孔板每孔接种2500个细胞，在第0小时、24小时、48小时、72小时、96小时加入CCK-8试剂，经过孵育后进行吸光度检测，记录结果并绘制生长曲线。
　　8、Transwell细胞侵袭实验
　　细胞侵袭能力采用transwell小室实验进行检测。用RPMI-1640培养基按比例稀释BD基质胶，取50μl均匀铺于transwell小室，4小时后每孔加入200μl细胞悬液，浓度为25万/ml，将transwell小室置于含有血清的培养基中进行培养，24小时后进行染色，细胞计数。
　　9、细胞周期检测
　　细胞周期检测应用凯基生物的细胞周期检测试剂盒进行，将细胞消化收集，应用70％乙醇过夜固定后使用PI染色，最后采用流式细胞仪进行检测。
　　10、临床标本采集
　　94例胃癌组织标本均取自2007年11月-2009年5月年在中国医科大学附属第一医院诊断为胃癌并接受手术切除患者的癌组织，与其配对的癌旁非癌组织是距离癌灶5cm以上的非癌组织。标本采集前均通过中国医科大学附属第一医院医学科学研究伦理委员会批准及患者知情同意。所有标本都于手术过程中采集，术中切取后立即置于液氮中保存并转入-80℃长期保存。肿瘤组织学分期根据第七版International Union against Cancer(UICC)/American Joint Committee onCancer(AJCC) TNM分期标准进行评估。患者在术前均未接受任何局部或系统治疗。截止到2014年2月，每3-6个月对患者进行随访，记录患者的生存状态，失访4例。
　　11、lncRNA的表达与临床病理资料之间的关系
　　对目的lncRNA表达与临床病理资料之间的关系进行统计学分析，探究其表达与患者的性别、年龄、肿瘤大小、TNM分期、肿瘤侵袭深度等临床病理资料的相关性。
　　12、统计学分析
　　所有的统计学分析均使用SPSS V19.0(SPSS Inc.，Chicago，IL，USA)软件及GraphPad Prism V5.0软件完成。RNA表达水平采用2-ΔΔCt法进行统计。LncRNA表达差异应用Student's t检验;lncRNA表达水平与病人临床病理资料之间的关系采用非参检验进行统计;临床病理资料与生存之间关系应用单因素或多因素回归分析法进行分析;生存分析采用Kaplan-Meier法进行计算。比较两组间差异采用Man-Whitney U检验，比较三组及三组以上采用Krushal-Walls检验，结果用均数±标准差（Mean±SD）表示。所有结果以P＜0.05为有显著性差异。
　　结果:
　　1、LncRNAs在胃癌细胞系中的表达
　　相比于人正常胃粘膜细胞系GES-1，lncRNA-CTD-2108O9.1表达在胃癌细胞系SGC-7901(P＜0.05)，BGC-823(P＜0.01)，HGC-27(P＜0.05)以及AGS(P＜0.01)中显著降低。而相比于人正常胃粘膜细胞系GES-1， lncRNA-KRTAP5-AS1在胃癌细胞系SGC-7901(P＜0.01)，BGC-823(P＜0.01)，HGC-27(P＜0.01)以及AGS(P＜0.01)中显著高表达。
　　2、LncRNA s过表达稳定细胞系构建
　　针对lncRNA-CTD-2108O9.1以及lncRNA-KRTAP5-AS1序列，以pEX2或pcDNA3.1质粒载体构建lncRNA过表达质粒载体pEX2-CTD-2108O9.1以及pcDNA3.1-KRTAP5-AS1及阴性对照载体pEX2-NC，pcDNA3.1-NC。在SGC-7901细胞系内应用lipo2000试剂对质粒载体进行转染，转染的细胞应用G418进行稳定细胞株筛选。多次传代后， Real-time PCR验证lncRNA表达水平基本维持不变，证明胃癌lncRNA-CTD-2108O9.1以及lncRNA-KRTAP5-AS1稳定过表达细胞株构建成功。
　　3、细胞增殖检测结果
　　CCK8检测结果提示，在0、24、48、72、96小时检测pEX2-CTD-2108O9.1与pEX2-NC细胞生长并无显著统计学差异;转染lncRNA-KRTAP5-AS1能在第96小时促进细胞增殖能力，而miR-596能够抑制lncRNA-KRTAP5-AS1的作用。
　　4、细胞侵袭检测结果
　　Transwell实验统计结果显示，pEX2-CTD-2108O9.1组细胞(8.49±2.77，P＜0.05)穿透基质胶的数量远远少于pEX2-NC(29.63±8.18)组和SGC-7901空白对照组(29.44±10.58);对比pcDNA3.1细胞， lncRNA-KRTAP5-AS1过表达能够显著促进细胞的侵袭能力。转染miR-596能够拮抗lncRNA-KRTAP5-AS1的作用。
　　5、细胞周期结果
　　细胞周期统计结果显示，lncRNA-CTD-2108O9.1、KRTAP5-AS1对胃癌细胞在G0/G1，G2/M及S期的分布无明显作用。
　　6、LncRNA-CTD-2108O9.1与靶基因的关系
　　PCR与Western blotting结果显示，过表达lncRNA-CTD-2108O9.1能够显著上调LIFR基因的蛋白表达水平。
　　7、LncRNAs在胃癌组织中的表达
　　利用2-ΔΔCt法进行相对定量分析，发现纳入研究的94例病人中胃癌组织比癌旁非癌组织，lncRNA-CTD-2108O9.1表达显著降低(P＜0.05)。而lncRNA-KRTAP5-AS1在胃癌组织及癌旁非癌组织间表达无显著差异(P＞0.05)。
　　8、LncRNA s与胃癌病理资料的关系
　　在胃癌组织中，lncRNA-CTD-2108O9.1，KRTAP5-AS1表达量与病人的临床病理资料进行相关性分析，得出lncRNA-CTD-2108O9.1表达与临床病理因素包括性别、年龄、肿瘤大小、TNM分期、肿瘤侵袭深度、淋巴结转移等并无显著相关性。lncRNA-KRTAP5-AS1表达与患者年龄显著相关，年龄小于60岁的患者其表达要高于60岁以上患者。
　　9、LncRNA s与胃癌患者预后的关系
　　在所有患者的生存分析中，lncRNA-CTD-2108O9.1及lncRNA-KRTAP5-AS1的表达与预后并无明显相关性。亚组分析结果显示在T1+T2期及TNM分期Ⅰ、Ⅱ期的患者中， lncRNA-CTD-2108O9.1高表达患者有着相对较好的预后。
　　结论:
　　1、lncRNA-CTD-2108O9.1在胃癌细胞系中显著低表达。
　　2、lncRNA-KRTAP5-AS1在胃癌细胞系中显著高表达。
　　2、lncRNA-CTD-2108O9.1能够抑制胃癌细胞侵袭。
　　3、lncRNA-CTD-2108O9.1在转录后水平调控其靶基因LIFR的表达。
　　4、lncRNA-KRTAP5-AS1促进胃癌细胞的增殖。
　　5、lncRNA-KRTAP5-AS1促进胃癌细胞的侵袭。
　　6、MiR-596可负性调控lncRNA-KRTAP5-AS1的促癌作用。
　　7、lncRNA-CTD-2108O9.1在胃癌组织中显著低表达。
　　8、lncRNA-KRTAP5-AS1的表达与患者年龄具有显著相关性。
　　9、T1+T2期及TNM分期Ⅰ、Ⅱ期的患者中， lncRNA-CTD-2108O9.1高表达患者有着相对较好的预后

目录

声明

摘要

英文缩略语

第一部分：LncRNA-CTD-210809．1、KRTAP5-AS1在胃癌细胞系中的表达

1 前言

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

3 实验结果

3．2、LncRNA-KRTAP5-AS1在胃癌细胞系中的表达情况

4 讨论

5 结论

第二部分：LncRNA-CTD-210809．1、KRTAP5-AS1在胃癌中的功能及相关机制

1 前言

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．2、实验方法

3．1 稳定转染细胞的鉴定

3．2 IncRNA-CTD-210809．1对胃癌细胞侵袭能力的影响

3．3 IncRNA-CTD-210809．1对胃癌细胞增殖的影响

3．4 IncRNA-CTD-210809．1对胃癌细胞周期的影响

3．5 LIFR受IncRNA-CTD-210809．1正向调节

3．6 MiR-596靶向调控IncRNA-KRTAP5-AS1

3．7 IncRNA-KRTAP5-AS1对胃癌细胞增殖的影响

3．8 IncRNA-KRTAP5-AS1对胃癌细胞侵袭能力的影响

3．9 IncRNA-KRTAP5-AS1对胃癌细胞周期的影响

4 讨论

5 结论

第三部分：LncRNA-CTD-210809．1、KRTAP5-AS1在胃癌组织中的表达

1 前言

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

3 实验结果

3．2 LncRNA-CTD-210809．1的表达与临床病理资料的关系

3．3 LncRNA-CTD-210809．1表达与预后的关系

3．4 LncRNA-KRTAP5-AS1在胃癌组织中的表达情况

3．6 LncRNA-KRTAP5-AS1表达与预后的关系

4 讨论

5 结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 LncRNA在消化道肿瘤中的研究进展

在学期间科研成绩

致谢

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