非离子型双聚体对比剂粘度对大鼠肾损伤作用的观察及功能磁共振成像评价研究

摘要

目的：放射诊断和介入治疗都需要注射含碘对比剂(contrast agent，CA)。但是，对比剂肾病(contrast-induced nephropathy, CIN)或对比剂急性肾损害(contrastinduced acute kidney injury, CI-AKI)是CA注射之后的严重并发症之一，是仅次于肾灌注不足和肾毒性药物引起医院获得性肾衰的第三大常见原因。CIN危害严重，会延长患者住院时间，增加院内全因病死率，加速慢性肾疾病(chronic kidneydisease，CKD)的进展。所以，这一医源性问题需要受到重视。研究CIN的发病机制、危险因素具有重要的临床意义。CIN的发病机制尚未完全阐明，可能与肾脏低氧和CA对肾小管细胞的直接毒性作用有关。对比剂的剂量和物理化学特性，包括离子性、渗透压和粘度是CIN的危险因素。非离子型对比剂较离子型安全，所以是临床常规使用的含碘对比剂。非离子型对比剂可以分为单聚体低渗对比剂(low-osmolar CA，LOCA)和双聚体等渗对比剂(iso-osmolar CA，IOCA)。IOCA的渗透压与血浆相等且约为LOCA的二分之一。但是在相同碘浓度下，IOCA的粘度远远高于LOCA。有研究认为，等渗较低渗对比剂引起的CIN发生率更高，并将这归因于非离子型双聚体等渗对比剂的高粘度。目前，对比剂物理特性粘度与CIN的关系已成为继渗透压之后的研究热点。但在以往的研究中粘度不是唯一可控变量，对比剂之间的渗透压、分子构型等方面存在不同，是影响结果的混杂因素。慢性肾疾病被认为是CIN最重要的危险因素，会增加CIN的发病率。CIN无特异性的治疗方法。对CKD患者碘对比剂肾损害的机理进行深入研究，可以明确碘对比剂对CKD肾脏作用的环节。在非离子型有机碘CA的化学结构和渗透压固定的条件下，研究CA的粘度对CKD肾脏结构和功能的影响，有助于深入明确CA粘度对CKD肾脏损害与正常肾脏损害之间的差异，避免用正常人的对比剂选择方法和使用标准来对CKD患者进行检查，从而制定适于CKD的碘对比剂粘度，最大限度地保护CKD患者的肾脏。本研究旨在通过动物实验，在固定渗透压的情况下观察不同粘度非离子型双聚体等渗对比剂对正常大鼠和CKD大鼠肾脏的损伤作用，应用功能磁共振(functional magnetic resonance imaging，fMRI)血氧水平依赖性成像(bloodoxygenation level dependent imaging，BOLD)和弥散张量成像(diffusion tensorimaging，DTI)成像监测不同粘度CA注射后大鼠肾脏氧含量、表观弥散系数(apparent diffusion coefficient，ADC)、各向异性分数(fractional anisotropy, FA)的动态变化，并与肾脏组织学改变和缺氧标志物低氧诱导因子-1α(hypoxia-induciblefactor-1α，HIF-1α)免疫组化结果进行对照研究，评估功能磁共振成像监测CI-AKI的价值和作用，为提高含碘对比剂临床应用的安全性、合理性提供参考。
　　方法：⑴对比剂选用渗透压固定不变(37℃下为290mOsm/kg H2O)而粘度依次递增的三种非离子型双聚体对比剂碘克沙醇270、320和350(37℃下粘度依次为5.7、11.1和17.3 mPa)。⑵63只正常雄性Witar大鼠(280-320g)，在无任何干预措施下处死3只，以获得正常肾脏组织。其余60只随机等分为4组，生理盐水组、270组、320组和350组，每组15只大鼠。大鼠腹腔麻醉后分别于盐水和CA注射前、注射后1h、24h、48h和72h进行右肾冠状位BOLD和DTI扫描。经文献查阅与预实验，实验中三种对比剂的碘(iodine，I)注射量选用4gI/kg体重。生理盐水的注射容积与CA相同。对比剂和盐水注射后的每个时间点的扫描结束后，每组处死三只大鼠，留取右肾待做病理检查。⑶雄性Wistar大鼠(280g-340g)，0.75％腺嘌呤饲料(300mg腺嘌呤/kg体重/天)连续饲养28d，共造模CKD大鼠63只。在无任何干预措施下处死3只，以获得基线状态下的CKD肾脏组织。其余60只随机等分为4组，生理盐水组、270组、320组和350组，每组15只大鼠。其余步骤同正常Wistar大鼠。⑷经GE-ADW4.4工作站的Functool软件后处理BOLD图像，获得R2*图像;后处理DTI图像，获得ADC和FA图。在R2*、ADC、FA图上，于正常鼠肾脏的皮质(cortex，CO)、外髓外带(outer stripe of outer medulla，OSOM)、外髓内带(inner stripe of outer medulla，ISOM)和内髓(inner medulla，IM)和CKD鼠肾脏的CO和ISOM放置半月状感兴趣区(regions of interest，ROI)以测量R2*、ADC、FA值。保证每个ROI不小于8mm2。⑸将大鼠右肾沿长轴对半切开，4％多聚甲醛溶液固定。标本脱水后石蜡包埋，切成5μm厚冠状面切片，进行苏木素-伊红染色，采用光学显微镜观察病理表现并评分。⑹采用抗生蛋白链菌素-生物素-过氧化物技术检测HIF-1α的表达水平。5μm厚石蜡切片脱蜡、水化后依次进行微波炉加热抗原修复，3％过氧化氢室温孵育阻断内源性过氧化物酶、正常山羊血清封闭、一抗HIF-1α(1∶200稀释)孵育、二抗孵育、辣根过氧化物标记、二氨基联苯胺显色和苏木素复染。采用光学显微镜于×400视野下随机观察肾小管上皮细胞胞核中HIF-1α的表达情况并评分。⑺数据均以均数±标准差表示，采用SPSS20.0和GraphPad prism6.0统计数据。对于重复的R2*、ADC和FA功能磁共振参数，符合正态分布时分别采用单因素方差分析和重复测量方差分析进行组间、组内比较;不符合正态分布时，分别采用Kruskal-Wallis test和Friedman test进行组间和组内比较。对于组织学和免疫组织化学评分，组间和组内比较均采用Kruska l-Wallis test。采用Spearman相关分析肾组织损伤评分、HIF-1α表达水平与fMRI参数的相关性。以P＜0.05为差异具有统计学差异。
　　结果：①与基线值相比对比剂注射后肾脏的四个解剖层CO、OSOM、ISOM、IM内的ΔR2*迅速上升，在1小时达到最高值，之后下降并在72h内恢复到基线水平;ΔADC和ΔFA值迅速下降，均在1小时达到最低值，之后上升并在72h内恢复到基线水平，而盐水注射前后ΔR2*、ΔADC和ΔFA无明显变化。对比剂注射后1h肾组织损伤最明显，病理表现为近曲小管上皮细胞胞浆空泡形成、肾小管管腔碎屑堆积和肾小管扩张。对比剂注射后肾小管上皮细胞胞核内HIF-1α表达水平升高，1h时表达水平最高。对比剂粘度越高，ΔR2*、ΔADC和ΔFA变化幅度越大，肾组织损伤越重，HIF-1α表达水平越高。ΔADC、ΔFA和肾脏组织损伤评分，ΔR2*和HIF-1α表达水平具有线性相关性。②与基线值相比，生理盐水和三种对比剂注射后肾脏的CO、ISOM内各时间点的ΔR2*、ΔADC和ΔFA均无显著变化。生理盐水和对比剂注射后，各时间点下，四组间的ΔR2*、ΔADC和ΔFA无明显差异。生理盐水和三种对比剂注射前、后肾组织镜下表现无明显变化。与基线状态相比，生理盐水和三种对比剂注射后大鼠CO、ISOM肾小管上皮细胞胞核HIF-1α表达水平无明显变化。
　　结论：⑴在正常鼠肾，碘克沙醇对比剂注射后ΔR2*、ΔADC和ΔFA与肾脏HIF-1α免疫组织化学表达和肾组织损伤评分有线性关系，说明R2*、ADC和FA对判断组织氧含量和反映肾脏病理学变化具有重要价值。碘克沙醇对比剂的粘度越高，肾组织缺氧和损伤程度越重。碘克沙醇对比剂注射后1h，肾组织缺氧和损伤程度最重。⑵在4gI/kg体重的碘注射量下，碘克沙醇对比剂不会明显降低CKD大鼠肾脏氧含量，也不会明显影响CKD肾组织形态与结构。

目录

声明

摘要

英文缩略语

第一部分：非离子型双聚体等渗对比剂粘度对正常大鼠肾损伤作用的观察及功能磁共振成像评价研究

1 前言

2．1 实验材料

2．2 对比剂剂量的选择

2．3 实验方法

2．4 组织学分析

2．5 免疫组织化学分析

2．6 统计学分析

3 实验结果

3．1 对比剂注射后肾内ΔR2*的变化

3．2 对比剂注射后肾内ΔADC的变化

3．3 对比剂注射后肾内ΔFA的变化

3．4 组织学分析

3．5 免疫组织化学分析

3．6 fMRI参数与组织学、免疫组织化学分析的相关性

4 讨论

5 结论

第二部分：非离子型双聚体等渗对比剂粘度对慢性肾疾病大鼠肾损伤作用的观察及功能磁共振成像评价研究

6 前言

7．1 实验材料

7．2 实验方法

7．3 组织学分析

7．4 免疫组织化学分析

7．5 统计学分析

8 实验结果

8．1 对比剂注射后肾内ΔR2*的变化

8．2 对比剂注射后肾内ΔADC的变化

8．3 对比剂注射后肾内ΔFA的变化

8．4 组织学分析

8．5 免疫组织化学分析

9 讨论

10 结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 对比剂肾病功能磁共振成像研究进展

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

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