氧化应激调控基因p66shc对肝细胞衰老的影响及其在非酒精性脂肪性肝病发生发展中的作用

摘要

研究背景:非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)患病率与日俱增，已成为最常见的慢性肝病之一，它不再是人们传统观念中的良性疾病，也可以向终末期肝病进展，因此，对其发病机制的研究具有重要意义。NAFLD发生发展的分子机制尚未完全明确，最近研究表明细胞衰老与NAFLD密切相关，可能在疾病的发生发展中起重要作用。细胞衰老是细胞脱离正常周期不可逆地丧失增殖能力后进入的一种相对稳定的状态，主要表现在衰老相关β-半乳糖苷酶(senescence-associatedβ-galactosidase，SA-β-gal)活性的增高、细胞形态的变化、细胞周期的改变、端粒缩短及衰老基因p53、p21、p16等的表达增加，另外细胞在衰老过程中，生物活性因子如粘附因子及炎性因子等分泌增多，这些变化都可能对细胞功能造成影响而导致疾病的发生。研究发现NAFLD中存在肝细胞衰老现象，表现为过早的端粒缩短、细胞核增大、p21表达增加;且端粒缩短、p21表达增加等细胞衰老现象与纤维化程度及疾病进展不良后果肝细胞癌(Hepatocellularcarcinoma，HCC)等相关。细胞衰老极可能是诱导及促进NAFLD的重要作用分子靶点，对细胞衰老相关机制及分子信号通路的研究为NAFLD的防治提供了重要线索。
　　NAFLD和衰老有着共同的机制-氧化应激，目前认为NAFLD状态下，线粒体过度产生的活性氧(Reactive oxygen species，ROS)可以促进肝细胞损伤;同时，氧化应激可通过DNA损伤、端粒缩短以及直接调控衰老相关信号通路等多种途径引起细胞衰老，可能是导致NAFLD肝细胞衰老的直接原因，但确切机制尚不明确。线粒体衔接蛋白p66shc是Shc家族成员中的一员，是细胞内氧化应激的重要调控者，在线粒体ROS形成中发挥重要作用，同时，p66shc是一种重要的调控细胞衰老的蛋白，其在调节血管内皮细胞及心肌细胞衰老过程中起重要作用，参与了心脏损伤、糖尿病内皮细胞功能紊乱及肾脏疾病的发生发展。氧化应激调控基因p66shc是否为调控肝细胞衰老并参与NAFLD疾病进展的重要原因机制仍有待阐明，对其进行系统的研究有望为NAFLD的防治提供一个新的方法。
　　目的:观察NAFLD中细胞衰老相关标志物及p66shc的表达，并分析相关性，探讨细胞衰老与p66shc的关系及在疾病进展中的作用;进一步敲低及过表达p66shc后，观察细胞衰老及脂肪变的变化，研究p66shc与细胞衰老的因果关系及对疾病的影响。
　　研究方法:1、选取NAFLD患者外周血标本100例，肝组织标本37例，及正常入外周血标本100例，通过real-time PCR的方法检测外周血白细胞端粒长度(leucocyte telomere length，LTL)的变化，免疫组化的方法检测肝组织p21、p66shc的表达，分析细胞衰老指标与p66shc表达的相关性及其与疾病进展的联系;
　　2、SD大鼠20只，随机分为高脂饮食组（10只）和正常对照组（10只），高脂高胆固醇饮食构建NAFLD模型，8周后处死，检测肝组织p66shc及衰老指标p53、p21、p16、HP1-γ、r-H2A.X、SA-β-gal等的表达，并分析相关性，在NAFLD大鼠模型中进一步探讨细胞衰老与p66shc的关系;
　　3、体外培养肝癌细胞株(hepG2)，采用双氧水诱导细胞衰老模型，检测p66shc及衰老指标p53、p21、p16、SA-β-gal等的表达及细胞脂肪变的变化，在此基础上进一步通过慢病毒转染shRNA敲低p66shc，观察对衰老指标p21、SA-β-gal及脂肪变的影响;此外，常规培养人正常肝细胞株（L-02），p66shc过表达质粒转染L-02细胞后，观察衰老指标p21、SA-β-gal及细胞脂肪变的变化，在体外研究p66shc与细胞衰老的因果关系及对脂肪变的影响。
　　结果:1、与对照组比较，NAFLD患者LTL明显缩短，并与肝组织p21表达明显相关，且两者与肝脏纤维化程度显著相关(p＜0.05);进一步分析发现p21表达及LTL变化与p66shc的表达显著相关(p＜0.05)，且p66shc与肝组织脂肪变及纤维化显著相关(p＜0.05)。
　　2、SD大鼠高脂高胆固醇饮食8周可成功构建NAFLD模型，与对照组比较，高脂高胆固醇饮食组大鼠体重明显增加，血清ALT、AST及血脂等明显升高，肝脏显著增大且脂肪变炎症明显加重(p＜0.05);NAFLD组大鼠肝组织p66shc及衰老指标p21、p16、HP1-γ、r-H2A.X及SA-β-gal的表达明显增多(p＜0.05)，且衰老指标与p66shc的表达显著相关(p＜0.05)。
　　3、双氧水处理hepG2细胞后可成功诱导衰老模型，与对照组比较，双氧水处理组衰老指标p21、p16、SA-β-gal的表达明显增多，且p66shc的表达明显升高并与衰老指标表达显著相关，细胞脂肪变程度加重(p＜0.05);进一步慢病毒转染shRNA敲低p66shc后，p66shc表达明显降低，且敲低p66shc对双氧水刺激引起的hepG2细胞衰老有保护作用，与未敲低组比较，衰老指标p21、SA-β-gal的表达明显降低，同时发现细胞脂肪变程度减轻(p＜0.05);p66shc过表达质粒转染组较空载体质粒转染组，L-02细胞中p66shc表达明显增多，衰老指标p21及SA-β-gal的表达明显升高，细胞脂肪变程度加重(p＜0.05)。
　　结论:体内实验证实NAFLD中细胞衰老指标及p66shc表达增高，且两者具有显著相关性，提示细胞衰老与p66shc联系密切，并可能参与了NAFLD疾病的发生发展;体外实验证实，敲低p66shc对双氧水刺激引起的hepG2细胞衰老具有保护作用，细胞衰老表达明显降低，且脂肪变减轻;过表达p66shc可加剧L-02的细胞衰老，并加重细胞脂肪变，提示p66shc与细胞衰老存在因果关系，并在NAFLD疾病发生发展中发挥重要作用，为NAFLD的防治提供了新的分子机制及实验依据。

目录

声明

摘要

英文缩略语

前言

第一部分 NAFLD患者外周血白细胞端粒长度变化，肝组织p21、p66shc的表达及其与疾病进展的关系

1．1 材料与试剂

1．2 实验方法

2．1 研究对象的临床资料

2．2 NAFLD患者肝组织病理学结果

2．3 NAFLD患者与正常对照LTL的比较

2．4 NAFLD患者肝组织p21的表达及与LTL的相关性分析

2．5 LTL、肝组织p21与NAFLD肝组织病理严重程度的相关性分析

2．6 NAFLD患者与正常对照血清SOD活性和MDA含量的比较以及与LTL的相关性分析

2．7 NAFLD患者肝组织p66shc的表达及与LTL、肝组织p21等衰老指标的相关性分析

2．8 p66shc与NAFLD肝组织病理严重程度的相关性分析

3 小结

第二部分 p66shc及衰老指标在高脂高胆固醇饮食诱导的NAFLD大鼠肝组织中的表达

1．1 材料与试剂

1．2 实验方法

2．1 大鼠的一般情况及生化指标

2．2 大鼠肝组织病理

2．3 大鼠肝组织SA-β-gal的表达

2．4 大鼠肝组织细胞衰老标志物p53、p21、p16、HP1-γ、r-H2A．X的表达

2．5 大鼠肝组织SOD活性和MDA含量以及与细胞衰老指标p53、p21、p16表达的相关性分析

2．6 大鼠肝组织p66shc的表达

2．7 大鼠肝组织p66shc表达与细胞衰老指标p53、p21、p16表达的相关性分析

2．8 大鼠肝组织p66shc表达与脂质代谢相关指标HDL、LDL、TC、TG的相关性分析

2．9 大鼠脂质代谢相关指标HDL、LDL、TC、TG与细胞衰老指标p53、p21、p16的相关性分析

3 小结

第三部分 体外探讨p66shc对肝细胞衰老及脂肪变的影响

1．1 材料与试剂

1．2 实验方法

2 结果

2．1 双氧水诱导HepG2细胞衰老模型的建立

2．2 重组慢病毒转染HepG2敲低p66shc观察对细胞衰老及脂肪变的影响

2．3 p66shc质粒转染L-02细胞观察对细胞衰老及脂肪变的影响

3 小结

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 细胞衰老与p66shc的关系及其在非酒精性脂肪性肝病发生发展中的作用

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

个人简历