肝细胞核因子HNF1α在非酒精性脂肪性肝病发生发展中的作用及机制研究

摘要

[研究背景及目的]
　　随着全球肥胖人群的不断增多，非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liverdisease，NAFLD)已成一种常见疾病，其发病呈现出逐年递增的趋势。近年来，多项研究证明，NAFLD患者常与肥胖、高血糖、高血脂、高血压等疾病伴随发生，与2型糖尿病(Type2 diabetes mellitus，T2DM)、代谢综合征以及心、脑血管疾病密切相关。NAFLD和T2DM的共同发病机制是胰岛素抵抗，两者相互促进，相互恶化，已成为近年来临床治疗的新挑战。
　　肝细胞核因子（hepatocyte nuclear factor，HNFs）是一类在肝脏优势表达的转录因子，目前已发现的HNF成员包括5种，它们分别是HNF1、HNF3、HNF4、HNF6以及CCAAT/增强子结合蛋白(C/EBP)。HNFs通过准确调控下游多种重要的肝细胞功能基因表达，在肝脏发育和肝细胞分化以及功能维持中起关键作用。其中HNF1α是HNFs家族的主要成员之一，属于POU-同源结构域家族。HNF1α在肝脏中表达水平最高，在肾脏、小肠、胰腺β细胞中也有一定的表达，它对肝脏中许多的重要功能基因进行调控，对肝脏的发育中是不可或缺的。以往针对HNF1α的研究中分为两方面:(1) HNF1α全身敲除小鼠出现高血糖和高脂血症。(2) HNF1α基因失活突变后，异常的HNF1α蛋白抑制肝脏脂肪酸结合蛋白(L-FABP)的功能，使肝细胞脂肪酸转运功能损害，最终导致肝细胞内脂质沉积。以上研究结果提示HNF1α可能是脂肪肝和糖尿病发生发展过程中的抑制因子，但该推论还需进一步证实。
　　基于以上研究背景，本研究首先通过建立NAFL模型小鼠，观察HNF1α在其肝脏中的表达变化，分析相关性;利用Cre-LoxP重组酶系统，首次获得了肝细胞特异性敲除HNF1α小鼠，通过该小鼠研究分析HNF1α在NAFLD形成过程中发挥的作用，探究胰岛素抵抗和血糖升高是否会促进NAFLD患者肝脏出现不良结局，如肝硬化或肝癌等;运用腺相关病毒特异性上调肝细胞中HNF1α表达，观察其是否能改善NAFLD症状;利用以上模型进一步探索其中的机制。
　　[实验方法]
　　一、 HNF1α在NAFL模型小鼠肝脏中的表达情况
　　利用高脂饲料建立了非酒精性脂肪肝模型小鼠。利用IPGTT方法检测小鼠末梢血糖情况，通过肝组织病理学染色观察肝脏形态学表现，从而判断造模是否成功。提取肝脏组织RNA，通过Real-time PCR检测肝组织中糖脂代谢基因ACC、FAS、SREBP-1c、GCK、PEPCK和炎症因子TNFα、TGFβ、IL-6的表达量，提取肝脏组织RNA和蛋白，利用Real-time PCR、western blot和免疫组织化学方法，检测肝组织中HNF1α的表达水平。
　　二、特异性调控肝细胞HNF1α对小鼠非酒精性脂肪性肝病发生发展的作用
　　1、Hnf1αH-KO小鼠的建立
　　利用基因打靶技术建立Hnf1αf/f小鼠，将Hnf1αf/f小鼠与Alb-Cre小鼠杂交，获得的杂合子小鼠之间再次杂交后，可获得Hnf1αf/f和Hnf1αH-KO两种基因型小鼠。通过鼠尾DNA抽提，普通PCR技术扩增目的基因和琼脂糖凝胶电泳技术检测小鼠基因型，并根据结果将Hnf1αf/f和Hnf1αH-KO两种基因型小鼠进行区分并分组。
　　2、各组织和肝细胞中HNF1α表达情况的检测
　　提取Hnf1αf/f和Hnf1αH-KO小鼠肝脏、胰腺、小肠和肾脏组织RNA和蛋白，利用Real-time PCR、western blot和免疫组织化学方法，检测HNF1α mRNA和蛋白的表达水平。分离Hnf1αf/f和Hnf1αH-KO小鼠原代肝细胞和非实质细胞，提取细胞中的蛋白，利用western blot方法检测HNF1α蛋白的表达水平。
　　3、Hnf1αH-KO小鼠肝脏形态学表现及糖脂代谢基因检测
　　处死10周龄、30周龄Hnf1αf/f和Hnf1αH-KO小鼠，通过肝组织病理学染色观察肝脏形态学表现，并进行病理学评估。收集Hnf1αf/f和Hnf1αH-KO小鼠血清，检测小鼠血清中CHOL、TG、LDL-C3和ALT的表达水平。利用Hnf1αf/f和Hnf1αH-KO小鼠肝组织匀浆检测肝组织中TG表达量。提取Hnf1αf/f和Hnf1αH-KO小鼠肝脏RNA和蛋白，利用Real-time PCR和western blot方法，检测糖脂代谢相关基因ACC、SREBP-1c、FAS、GCK、GCKR和纤维化相关基因Collagen1、α-SMA的表达水平。
　　4、于NAFL模型小鼠中特异性上调肝细胞HNF1α表达
　　(1)空白对照组(CTR AAV-TBG)的建立:普通饲料喂养C57BL/6小鼠5只，于第10周尾静脉AAV-TBG（2×1011 Vg/只，1次），于第20周时处死小鼠
　　(2)对照组和实验组的建立（HFD AAV-TBG&HFD AAV-HNF1α）:高脂饲料喂养C57BL/6小鼠建立NAFL模型小鼠，于高质饮食第10周将NAFL模型小鼠随机分为2组，每组各5只，分别通过尾静脉注射AAV-TBG和AAV-HNF1α(2×1011 Vg/只，1次)，于第20周处死各组小鼠
　　5、观察NAFL模型小鼠肝细胞过表达HNF1α后肝脏形态学表现及肝脏糖脂代谢基因的检测
　　取CTR AAV-TBG组、HFD AAV-TBG组和HFD AAV-HNF1α组小鼠肝组织进行病理学染色并观察肝脏形态学变化。提取以上三组小鼠肝组织中RNA和蛋白，利用Real-time PCR和western blot方法，检测糖脂代谢相关基因ACC、SREBP-1c、FAS、GCK、GCKR和纤维化相关基因Collagen1、α-SMA的表达水平。
　　三、HNF1α抑制非酒精性脂肪性肝病发生发展的机制研究
　　1、利用10周龄、30周龄和70周龄Hnf1αH-KO小鼠，通过Real-time PCR和免疫组织化学方法，检测肝组织中炎症因子TNFα、TGFβ、IL-6的mRNA和蛋白水平，通过western blot方法检测肝组织STAT3和p65的蛋白水平。
　　2、利用10周龄Hnf1αH-KO小鼠原代肝细胞，通过Real-time PCR方法检测原代肝细胞中炎症因子TNFα、TGFβ、IL-6的mRNA水平，通过western blot方法检测原代肝细胞中STAT3和p65的蛋白水平。
　　3、利用CTR AAV-TBG组、HFD AAV-TBG组和HFD AAV-HNF1α组小鼠，利用免疫组化方法，检测肝脏内炎症因子TNFα、TGFβ、IL-6的蛋白表达，通过western blot方法检测肝脏内STAT3和p65的蛋白水平。
　　五、统计学分析
　　数据运用SPSS18.0软件进行相关统计分析，多组间采用One-WayANOVA分析，配对资料采用配对t检验，方差非齐性则采用非参数检验，实验数据以X±SD表示，P＜0.05具有显著差异，P＜0.01具有非常显著差异。
　　[实验结果]
　　一、HNF1α在NAFL模型小鼠肝脏中的表达情况
　　(1) NAFL模型小鼠肝脏出现大量脂质沉积，于高脂饮食30wk时小鼠血糖升高，出现肝纤维化;
　　(2)与对照组小鼠相比，NAFL模型小鼠肝脏脂质合成相关基因ACC、FAS和SREBP-1c等mRNA的表达明显升高;
　　(3)与对照组小鼠相比，NAFL模型小鼠糖代谢关键酶GCK mRNA的表达显著降低，糖异生关键限速酶PEPCK mRNA的表达明显升高;
　　(4)与对照组小鼠相比，NAFL模型小鼠炎症因子TNFα、TGFβ和IL-6 mRNA的表达明显升高;
　　(5)与对照组小鼠相比，NAFL模型小鼠HNF1α基因mRNA的表达量在高脂饮食10wk时出现一过性升高后，于高脂饮食30wk时明显下调，western blot和免疫组化进一步确定NAFL模型小鼠肝脏中HNF1α的蛋白水平于高脂饮食30wk时表达显著下降。
　　二、特异性调控肝细胞HNF1α对小鼠非酒精性脂肪性肝病发生发展的作用
　　1、Hnf1αH-KO小鼠各组织和肝细胞中HNF1α表达的检测
　　(1)与Hnf1αf/f小鼠相比，Hnf1αH-KO小鼠肝脏中HNF1α mRNA和蛋白的表达明显下降;
　　(2)与Hnf1αf/f小鼠相比，Hnf1αH-KO小鼠小肠、肾脏和胰腺中HNF1α mRNA和蛋白水平的表达没有变化;
　　(3)与Hnf1αf/f小鼠相比，Hnf1αH-KO小鼠原代肝细胞中HNF1α蛋白水平的表达明显降低;
　　(4)与Hnf1αf/f小鼠相比，Hnf1αH-KO小鼠非实质细胞中HNF1α蛋白水平的表达没有变化。
　　2、Hnf1αH-KO小鼠血脂、肝功能及血糖情况的检测
　　(1)与Hnf1αf/f小鼠相比，Hnf1αH-KO小鼠于10周龄时出现血清总胆固醇(CHO-C3)明显升高、低密度脂蛋白(LDL-C3)降低;
　　(2)与Hnf1αf/f小鼠相比，Hnf1αH-KO小鼠谷氨酸-丙酮酸转氨酶(ALT)明显升高;
　　(3)与Hnf1αf/f小鼠相比，Hnf1αH-KO小鼠IPGTT检测显示，30周龄Hnf1αH-KO小鼠血糖水平分别于葡萄糖注射后60分钟和90分钟时升高。
　　3、Hnf1αH-KO小鼠肝脏形态学表现及糖脂代谢基因检测
　　(1)与Hnf1αf/f小鼠相比，10周龄Hnf1αH-KO小鼠出现肝脏脂质沉积，30周龄Hnf1αH-KO小鼠肝脏脂质沉积加重，炎症细胞浸润，出现肝纤维化，70周龄Hnf1αH-KO小鼠发生高分化型肝细胞癌;
　　(2)与Hnf1αf/f小鼠相比，Hnf1αH-KO小鼠肝脏脂质合成相关基因ACC、FAS和SREBP-1c mRNA的表达明显升高，Hnf1αH-KO小鼠肝脏内TG含量明显升高;
　　(3)与Hnf1αf/f小鼠相比，Hnf1αH-KO小鼠糖代谢关键酶GCK的mRNA表达量明显降低，GCK-GCKR比例明显降低;
　　4、NAFL模型小鼠肝细胞过表达HNF1α后肝脏内HNF1α表达的检测
　　(1)与CTR AAV-TBG组小鼠相比，HFD AAV-TBG组小鼠中肝脏内HNF1αmRNA的表达明显下降;
　　(2)与HFD AAV-TBG组小鼠相比，HFD AAV-HNF1α组小鼠肝脏内HNF1α在mRNA和蛋白水平均明显升高，并且高于CTR AAV-TBG组小鼠肝脏内HNF1α的表达水平。
　　5、NAFL模型小鼠肝细胞过表达HNF1α后肝脏形态学表现和糖脂代谢相关基因的检测
　　(1)与HFD AAV-TBG组小鼠相比，HFD AAV-HNF1α组小鼠脂肪肝症状明显改善，肝脏内未出现炎症细胞浸润，未见肝脏内纤维化形成;
　　(2)与HFD AAV-TBG组小鼠相比，HFD AAV-HNF1α组小鼠SREBP-1c、FAS和ACC mRNA的表达水平和肝组织TG含量明显降低;
　　(3)与HFD AAV-TBG组小鼠相比，HFD AAV-HNF1α组小鼠中GCK mRNA的表达明显升高，GCK-GCKR比例明显升高。
　　三、HNF1α抑制非酒精性脂肪性肝病发生发展的机制研究
　　1、Hnf1αH-KO小鼠肝组织中炎症因子和NF-κB、STAT3信号通路的检测
　　(1)与Hnf1αf/f小鼠相比，Hnf1αH-KO小鼠肝组织中TNFα、TGFβ1和IL-6 mRNA和蛋白的表达水平明显升高;
　　(2)与Hnf1αf/f小鼠相比，Hnf1αH-KO小鼠肝组织中STAT3和p65磷酸化水平明显升高。
　　2、Hnf1αH-KO小鼠肝细胞中炎症因子和NF-κB、STAT3信号通路的检测
　　(1)与Hnf1αf/f小鼠相比，Hnf1H-KO小鼠肝细胞中TNFα、TGFβ1和IL-6 mRNA表达水平明显升高;
　　(2)与Hnf1αf/f小鼠相比，Hnf1αH-KO小鼠肝组织中STAT3和p65磷酸化水平明显升高。
　　3、特异性上调NAFL模型小鼠肝细胞中HNF1α后肝脏内炎症因子和NF-κB、STAT3信号通路的检测
　　(1)与HFD AAV-TBG组小鼠相比，HFD AAV-HNF1α组小鼠肝组织中TNFα、TGFβ1和IL-6的蛋白水平明显降低;
　　(2)与HFD AAV-TBG组小鼠相比，HFD AAV-HNF1α组小鼠肝组织中STAT3和p65的磷酸化水平明显降低。
　　[结论]
　　1、HNF1α在NAFLD小鼠肝组织中表达显著降低，与血糖升高和炎症反应密切相关。
　　2、肝细胞特异性缺失HNF1α后小鼠自发NAFLD，并最终进展为肝细胞癌，提示HNF1α在NAFLD发生发展中起重要作用。
　　3、特异性上调肝细胞HNF1α表达显著改善NAFLD症状，有望成为NAFLD治疗的新靶点。
　　4、HNF1α可通过负向调节STAT3和NF-κB信号通路改善NAFLD的发生发展。

目录

声明

摘要

中英文缩略词对照表

前言

第一部分 HNF1α在NAFL模型小鼠肝脏中的表达变化

背景

材料与方法

结果

讨论

第二部分 特异性调控肝细胞HNF1α对小鼠NAFLD发生发展的作用

背景

材料与方法

结果

讨论

第三部分 HNF1α抑制NAFLD发生发展的作用机制

背景

材料与方法

结果

讨论

全文结论

参考文献

综述 肝细胞核因子的功能研究进展

在读期间科研成果

致谢