激素受体阳性乳腺癌预后相关生物标志物的筛选及机制研究

摘要

目的:乳腺癌位居世界女性癌症发病之首，最新统计显示全球每年新发乳腺癌病例约167.1万，约52.2万患者死于乳腺癌。乳腺癌也是我国发病率最高的女性恶性肿瘤，2015年仅新发乳腺癌高达27万例，严重威胁着女性的健康。
　　激素受体(Hormone receptor，HR)阳性乳腺癌大约占乳腺癌的70％。尽管HR阳性乳腺癌预后较好，接受内分泌治疗土化疗为主的综合治疗手段后能降低复发、延长生存。但由于乳腺癌的异质性很强，并非所有病人都对治疗有效，约50％的HR阳性的乳腺癌患者由于原发性或继发性内分泌治疗耐药并不能从辅助内分泌治疗中获益。对于HR阳性早期乳腺癌患者术后行辅助化疗也只能在降低部分预后较差患者的复发和转移风险。目前临床上很多HR阳性的乳腺癌患者即使接受了规范化治疗仍然出现了复发转移。因此，通过寻找新的预后相关的生物标志物来预测HR阳性乳腺癌患者术后复发、转移风险及指导术后治疗方案的选择有着非常重要的意义。
　　既往的研究显示通过多基因检测方法进行复发风险评分能预测HR阳性乳腺癌患者的预后。第一代多基因检测方法如Oncotype DX（21基因）、MammaPrint(70基因)、Genomic Grade Index（97基因）能有效预测HR阳性乳腺癌的早期复发（无病生存期（Disease-free survival，DFS）≤5年）风险。最近的研究显示，一些较新的多基因检测方法如Prosigna(PAM50，58基因)、EndoPredict、Breast Cancer Index不仅能预测HR阳性乳腺癌早期复发风险，还能预测晚期复发（DFS＞5年）风险。此外，一些权威的临床研究还证实根据Oncotype DX检测行复发风险评分不仅能预测绝经后HR阳性早期乳腺癌患者的预后，还能预测辅助化疗的疗效，改变化疗决定从而指导治疗。但多基因检测方法还不能预测远处转移，不同方法预测有20％-30％的结果并不一致，而且费用非常昂贵，临床普及率很低。因此目前仍然迫切需要寻找新的经济有效的预后相关生物标志物来预测HR阳性乳腺癌患者的复发、转移风险。
　　微小RNA（MicroRNAs，miRNA）为一类高度保守的内源性非编码单链小RNA。相对于mRNA，更适合作为生物标志物，主要有以下三个优势:其一，miRNA非常小，只有18-25个核苷酸，所以非常稳定;其二，miRNA在冰冻组织、福尔马林固定石蜡包埋组织标本（Formalin-fixed paraffin-embedded specimen，FFPE）、血清中均稳定表达，提取非常方便，而且很少被核糖核酸酶降解;其三，相对于几百万种mRNA表达谱，miRNA表达谱只有两千多种。因此，选择miRNAs作为HR阳性乳腺癌的生物标志物进行转移相关的机制研究有非常重要的临床应用价值。
　　既往研究发现一些miRNAs参与了乳腺癌转移的发生发展过程，与乳腺癌患者的预后密切相关。miR-21是乳腺癌中研究最多的促进肿瘤转移的miRNA，在乳腺癌患者的血清/冰冻组织/FFPE中高表达，在多项临床研究中提示miR-21高表达能促进乳腺癌的发展和转移、缩短DFS和总生存期(Overall survival，OS)。后来陆续发现一些促进肿瘤转移miRNAs，如miR-205、miR-210高表达能促进肿瘤的浸润和转移从而影响乳腺癌患者的预后。而Let7b、miR-30a则是目前研究较多的抑制肿瘤转移的miRNAs，研究发现低表达能明显促进乳腺癌复发、转移，缩短DFS和OS。但是既往乳腺癌转移相关miRNAs的研究主要以三阴性乳腺癌和人类表皮生长因子受体2（Human Epidermal Growth Factor2，HER-2）阳性乳腺癌为主，HR阳性乳腺癌相关的研究非常少，目前主要集中在内分泌治疗或化疗药物耐药相关的研究。
　　目前为止已经有超过2500种人类成熟miRNAs陆续被发现，但其中绝大多数miRNAs的功能还不为人知。基因表达数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）是现今最全面的公共表达数据资源，目前含有136多万个miRNAs相关的表达谱数据集。通过生物信息学方法可以从GEO的海量芯片数据中筛选出尚未被发现的、影响HR阳性乳腺癌预后的差异性表达miRNAs。
　　本研究第一部分通过生物信息学方法从GEO数据库中筛选影响HR阳性早期乳腺癌发生远处转移相关的差异性表达miRNAs。第二部分收集临床标本通过Real-time PCR法对所筛选miRNAs进行组织学检测，验证其表达水平与远处转移的关系。第三部分通过一系列细胞学实验验证所筛选的具有预后意义的miRNAs在HR阳性乳腺癌细胞系中的功能及机制探讨。研究结果将为预测HR阳性乳腺癌的预后提出新的生物标志物，并为研究HR阳性乳腺癌的发生、发展的作用机制和探索新的治疗靶点提供理论基础。
　　研究方法:1、从GEO公共数据库中采用生物信息学方法筛选与HR阳性、HER-2阴性早期乳腺癌术后发生远处转移相关的差异性表达miRNAs。利用R软件运行R语言对GSE59829原始矩阵数据归一化后分析差异性表达miRNAs数据，制作火山图、热图等。2、收集中国医科大学附属第一医院肿瘤内科经治的改良根治术后出现远处转移的HR阳性、HER-2阴性早期乳腺癌患者，并设定对照组，根据入选标准，最终62例患者入选。3、应用miRNeasy FFPE Kit试剂盒提取乳腺癌术后FFPE中包含miRNAs在内的总RNA。4、采用Real-time PCR法检测乳腺癌FFPE中和细胞系中miRNAs及解聚素与金属蛋白酶10(A Disintegrin and metalloproteinasedomain-containing protein10，ADAM10)的表达。5、采用Lipofectamine2000行瞬时转染将miRNA mimic、inhibitor及siRNA转染至T47D、MCF-7细胞。6、MTT法测定细胞活力。7、Transwell法测定细胞迁移能力。8、Western blot法检测ADAM10、β-actin蛋白的表达。9、双荧光素酶报告基因实验进行靶基因鉴定。10、所有数据采用3次独立实验结果，以均值±标准差（(x)±s）进行表示。采用IBMSPSS Statistics Version19.0统计分析软件进行统计学分析。生存分析采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，单因素分析采用log-rank检验分析生存率差异。组间比较采用student t检验，P＜0.05认为有统计学意义。
　　结果:1、GEO数据库筛选显示6个miRNAs在HR阳性早期乳腺癌组织中的差异性表达与远处转移密切相关。通过生物信息学统计方法利用R语言软件从GEO数据系列-GSE59829中1146个miRNAs中筛选出与HR阳性、HER-2阴性早期乳腺癌发生远处转移相关的差异性表达miRNAs，结合log FC及P Value值初步筛选出20个差异性表达miRNAs，并根据miRNAs在远处转移组中差异性表达水平分为低表达和高表达两组。通过文本挖掘尽量选择既往乳腺癌中很少或没有报道的miRNAs，最终入选了6个差异性表达miRNAs。其中，低表达组为miR-891a-5p、miR-383-5p、miR-1295a;高表达组为miR-128-3p、miR-661、miR-296-3p。通过SPSS软件对所筛选6个miRNAs进行统计分析、验证，分析差异性表达及生存数据，结果进一步印证了生物信息学分析的结果。
　　2、临床组织学验证发现miR-891a-5p及miR-383-5p与HR阳性早期乳腺癌术后发生远处转移密切相关。通过Real-time PCR法检测62例HR阳性早期乳腺癌术后切除FFPE中6个miRNAs的表达。结果显示，miR-891a-5p、miR-383-5p、miR-1295a在远处转移组FFPE中表达明显下降，差异倍数分别达到了-2.727、-2.150和-1.528。根据miRNAs差异性表达水平绘制ROC曲线，得出最佳诊断界点cut-off值和AUC。根据cut-off值将miRNAs分为低表达和高表达两组，结果显示，miR-891a-5p低表达(＜1.119)预测远处转移的敏感度和特异度分别为71.4％和82.4％，AUC为0.821。miR-383-5p低表达(＜1.148)预测远处转移的敏感度和特异度分别为53.4％和85.3％，AUC为0.737。根据miR-891a-5p及miR-383-5p表达水平按照cut-off值分组后，以远处转移作为终点事件行生存分析。结果显示， miR-891a-5p及miR-383-5p在FFPE中表达水平与HR阳性早期乳腺癌的远处转移生存密切相关。
　　3、miR-891a-5p及miR-383-5p能够抑制乳腺癌细胞的增殖。通过MTT实验检测上调或下调miR-891a-5p、miR-383-5p表达不同时间点对乳腺癌细胞增殖活力的影响。结果显示，上调miR-891a-5p及miR-383-5p表达后，细胞增殖明显减慢，而下调miR-891 a-5p及miR-383-5p表达后，细胞增殖明显加快。结果表明，miR-891a-5p及miR-383-5p能够抑制乳腺癌细胞的增殖。
　　4、miR-891 a-5p能够抑制乳腺癌细胞的迁移。通过Transwell实验检测上调或下调miR-891 a-5p表达对乳腺癌细胞迁移能力的影响。结果显示，上调miR-891a-5p表达后，乳腺癌细胞迁移能力明显减弱，而下调miR-891 a-5p表达后，乳腺癌细胞迁移能力明显增强。结果表明，miR-891a-5p能够抑制乳腺癌细胞的迁移。
　　5、ADAM10是miR-891a-5p的直接靶基因。通过4个miRNA靶基因预测网站，预测了miR-891a-5p的靶基因ADAM10。通过Western blot实验发现，上调miR-891a-5p表达后，乳腺癌细胞ADAM10蛋白表达显著下调。而下调miR-891a-5p表达后，乳腺癌细胞ADAM10蛋白表达明显上调。针对预测的miR-891a-5p靶向结合位点设计引物，扩增ADAM10基因相应3'端非编码区(untranslational region，UTR)序列，连接入双荧光素酶报告载体，构建针对miR-891a-5p结合位点ADAM10的293-2993'UTR区序列的荧光素酶报告(WT)及突变(MUT)质粒。乳腺癌T47D细胞同时转染miR-891a-5p mimic、pmirGLO-ADAM10-3'UTR(WT)、pmirGLO-ADAM10-3'UTR(MUT)。结果显示，和NC相比， pmirGLO-ADAM10-3'UTR(WT)报告载体的荧光素酶活性被miR-891a-5p明显抑制，而突变的pmirGLO-ADAM10-3'UTR(MUT)载体没有任何影响。以上结果证实ADAM10是miR-891 a-5p的直接靶基因，且结合位点位于ADAM10 mRNA的293-2993'UTR区序列。
　　6、沉默ADAM10能够抑制乳腺癌细胞的增殖及迁移。通过MTT实验检测沉默ADAM10的乳腺癌细胞的增殖活力。结果显示，沉默ADAM10后，乳腺癌细胞增殖活力明显受到抑制。通过Transwell实验检测沉默ADAM10的乳腺癌细胞的迁移能力。结果显示，沉默ADAM10后，乳腺癌细胞迁移能力也明显受到抑制。结果表明，沉默ADAM10能够抑制乳腺癌细胞的增殖及迁移。
　　7、miR-891a-5p通过下调ADAM10抑制乳腺癌细胞增殖及迁移。通过MTT检测同时沉默ADAM10和miR-891 a-5p下调后不同时间点细胞增殖活力。结果显示，相对于单独miR-891a-5p下调组，同时沉默ADAM10和miR-891a-5p下调后，乳腺癌细胞的增殖明显减慢。通过Transwell实验检测转染后迁移能力。结果显示，同时沉默ADAM10和miR-891 a-5p下调后，乳腺癌细胞迁移能力也明显减弱。以上结果表明沉默ADAM10能部分逆转miR-891a-5p下调对乳腺癌细胞增殖及迁移的促进作用，进一步证明miR-891a-5p通过直接靶向下调ADAM10表达从而抑制乳腺癌细胞增殖及迁移。
　　结论:1、GEO数据库筛选显示，6个miRNAs: miR-128-3p、miR-661、miR-296-3p、miR-891a-5p、miR-383-5p、miR-1295a在HR阳性早期乳腺癌中的差异性表达与远处转移密切相关。2、临床组织学验证发现，miR-891a-5p及miR-383-5p在组织中的表达水平与HR阳性早期乳腺癌术后发生远处转移密切相关，两者低表达能预测HR阳性早期乳腺癌的远处转移风险。3、miR-891a-5p及miR-383-5p能够抑制乳腺癌细胞的增殖。4、miR-891a-5p能够抑制乳腺癌细胞的迁移。5、ADAM10是miR-891a-5p的直接靶基因。6、沉默ADAM10能够抑制乳腺癌细胞的增殖及迁移。7、miR-891a-5p通过靶向下调ADAM10抑制乳腺癌细胞的增殖及迁移。

目录

声明

摘要

英文缩略语

第一部分：通过生物信息学方法从GEO数据库中筛选影响HR阳性早期乳腺癌发生远处转移的差异性表达microRNAs

1 前言

2．1 实验方法

3 实验结果

3．1 生物信息学方法初步预测GEO数据库中差异性表达的前20个miRNAs

3．2 生物信息学方法所预测GEO数据库中的6个差异性表达的miRNAs

3．3 所筛选的6个miRNAs在54例HR阳性早期乳腺癌组织中差异性表达情况

3．4 所筛选的6个miRNAs在54例HR阳性早期乳腺癌组织中的表达水平与远处转移生存的关系

4 讨论

5 结论

第二部分：miR-891a-5p及miR-383-5p与HR阳性早期乳腺癌术后发生远处转移密切相关

1 前言

2．1 主要试剂和仪器

2．2 临床验证研究入组设计、随访情况及实验方法

3 实验结果

3．1 6个miRNAs在HR阳性早期乳腺癌组织中的表达与远处转移的关系

3．2 miR-891a-5p、miR-383-5p及miR-1295a与HR阳性早期乳腺癌远处转移生存的关系

4 讨论

5 结论

第三部分：miR-891a-5p通过下调ADAM10抑制乳腺癌细胞的增殖及迁移

1 前言

2．1 主要试剂和仪器

2．2 实验方法

3 实验结果

3．1 miR-891a-5p及miR-383-5p能够抑制乳腺癌细胞的增殖

3．2 miR-891a-5p能够抑制乳腺癌细胞的迁移能力

3．3 ADAM10是miR-891a-5p的直接靶基因

3．4 沉默ADAM10能够抑制乳腺癌细胞的增殖及迁移

3．5 沉默ADAM10能够部分逆转miR-891a-5p下调对乳腺癌细胞增殖及迁移的影响

4 讨论

5 结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 乳腺癌术后局部复发预测相关因素及预后相关因素的研究进展

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

个人简历