miR-873调控GLI1基因在先天性心脏病中的作用研究

摘要

目的:
　　先天性心脏病（Congenital Heart Disease，CHD）是一类严重危害婴幼儿健康的先天畸形，在新生儿中的发病率为1％～2％，占新生儿非感染性死亡的首位。手术治疗不仅给患者及其家庭带来沉重的负担，而且近50％的患者要面临再次手术、心律失常、心力衰竭等问题。而CHD的无创产前诊断主要依靠超声影像检查，最佳时间为孕20～24周，虽有报道妊娠14周可诊断CHD，但诊断特异性较差，诊断率只有40％。因此，鉴定CHD易感基因并阐明其调控网络将具有重要的理论和实践意义。
　　微小RNA(miRNA)是一类长约18～24nt的内源性、非编码单链RNA分子，通过与靶基因3'-非翻译区(3'-UTR)互补结合，在转录后水平调控靶基因的表达。miRNA作为心血管系统重要的调控因子，参与心血管系统的正常发育和相关疾病的发生。研究者已鉴定了多种与CHD密切相关的miRNA，提示miRNA在CHD的发生、发展中发挥重要作用。
　　脑胶质瘤相关癌基因1（GLI1）编码一类具有五个锌指DNA结合基序的转录因子，表达于第二生心区，参与房室分隔、心脏流出道形成等。本课题组前期研究结果发现CHD患者心肌组织标本中GLI1基因表达降低，提示GLI1基因表达降低可能是其参与CHD发生的潜在机制。由于miRNA可在转录后水平调控靶基因表达，且在CHD的发生、发展中扮演重要角色，我们推测:CHD患者GLI1基因表达降低也可能受某个miRNA调控。通过生物信息学分析，我们在GLI1基因3'-UTR预测到miR-873的可能结合位点。我们设想:miR-873可能通过与GLI1基因3'-UTR互补结合，在转录后水平调控GLI1基因表达，进而参与CHD的发生。
　　因此，本研究以miRNA-873为切入点，首先，通过双荧光素酶报告基因实验鉴定miR-873与GLI1基因3'-UTR的靶向结合;其次，通过过表达和表达抑制实验（体外）以及心肌组织表达相关性分析（体内）阐明miR-873对GLI1基因表达的调控机制;再次，通过CHD患者外周血清中miR-873表达分析和体外心肌细胞生物学特性分析（细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡、细胞自噬）阐明miR-873在CHD的临床应用价值和作用机制;最后，通过恢复GLI1基因表达实验证明miR-873通过靶向调控GLI1基因表达而参与CHD发生。上述研究结果不仅为丰富GLI1基因转录后调控机制提供理论依据，而且有望为早期诊断CHD提供候选靶标。
　　方法:
　　1、实验材料:大鼠心肌细胞系H9C2、人胚肾细胞系HEK293、CHD患者心肌组织标本、CHD患者外周血清标本和正常对照外周血清标本。
　　2、实验方法:利用生物信息学软件（TargetScan、mirSVR、PicTar）预测GLI1基因3'-UTR潜在的miRNA结合位点。分别构建野生型和突变型GLI1基因3'-UTR荧光素酶报告基因载体，与miR-873mimic共转染HEK293细胞，应用双萤光素酶检测系统进行萤光素酶活性检测。分别利用miR-873mimics（过表达实验）和miR-873inhibitor（表达抑制实验）转染大鼠心肌细胞H9C2，Real-time RT-PCR和Western Blot进行GLI1基因表达分析。常规提取心肌组织RNA，Real-time RT-PCR检测miR-873和GLI1mRNA表达水平，并应用SPSS软件进行相关性分析。常规进行CHD患者外周血清miR-873表达分析，采用MedCalc13.0软件对miR-873进行受试者工作曲线(ROC)分析，通过曲线下面积(AUC)判断miR-873作为CHD早期诊断生物标志物的诊断价值、最佳诊断临界值、敏感性、特异性。分别利用miR-873mimics和miR-873inhibitor转染大鼠心肌细胞H9C2，分析miR-873对心肌细胞生物学特性（细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡、细胞自噬）的影响。共转染miR-873和GLI1基因表达载体pGL1进行恢复实验。
　　结果:
　　1、miR-873与GLH3'-UTR靶向结合。应用生物信息学软件在GLI13'-UTR175-180nt预测到miR-873可能结合位点。GLI13'-UTR与miR-873“种子序列”结合区域在人、猴、小鼠、大鼠、猪、牛等哺乳动物中具有高度保守性。miR-873mimics能够使wt-GLI1-3'UTR的荧光素酶活性降低（P＜0.05），而对mut-GLI1-3'UTR的荧光素酶活性无影响，提示miR-873能够与GLI13'-UTR靶向结合。
　　2、miR-873负调控内源性GLI1基因表达。与转染Negative Control相比，转染miR-873mimics后，GLI1mRNA和GLI1蛋白表达水平均降低(P＜0.01)，而转染miR-873inhibitor后，GLI1mRNA和GLI1蛋白表达水平均升高（P＜0.01），提示miR-873可以负调控内源性GLI1基因表达。
　　3、心肌组织中miR-873与GLI1基因表达呈负相关，Spearman相关系数r=-0.54(P＜0.05)。
　　4、与正常对照相比，CHD患者外周血清中miR-873表达升高（P＜0.05）。受试者工作曲线(ROC)分析显示曲线下面积(AUC)为0.812，标准误(SE)为0.05，95％置信区间为0.714～0.888(P＜0.01)，最佳诊断临界值为0.3221，敏感性为88.9％，特异性为60.9％，提示miR-873可以作为一个早期诊断指标应用于临床CHD的筛查。
　　5、miR-873过表达能够抑制心肌细胞增殖。与转染Negative Control相比，转染miR-873mimics后活细胞数显著减少，细胞增殖率降低，PCNA表达降低(P＜0.05)，而转染miR-873inhibitor后，活细胞数显著增多，细胞增殖率升高，PCNA表达升高(P＜0.05)，提示miR-873过表达能够抑制心肌细胞增殖。
　　6、miR-873过表达使细胞周期阻滞于G1期。与转染Negative Control相比，转染miR-873mimics后S期细胞数明显减少，Cyclin E1表达降低（P＜0.05），而转染miR-873inhibitor后S期细胞数明显增多，Cyclin E1表达升高（P＜0.05），提示miR-873过表达能够使细胞周期阻滞于G1期。
　　7、miR-873过表达不影响心肌细胞凋亡。与转染Negative Control相比，转染miR-873mimics或miR-873inhibitor后凋亡细胞无明显改变，凋亡指数也无明显变化(P＞0.05)，提示miR-873过表达不影响心肌细胞凋亡。
　　8、miR-873过表达不影响心肌细胞自噬。与转染Negative Control相比，转染miR-873mimics或miR-873inhibitor后P62表达水平无明显改变（P＞0.05），提示miR-873过表达不影响心肌细胞自噬。
　　9、miR-873过表达通过靶向GLI1基因而抑制心肌细胞增殖。与转染Negative Control+pcDNA3.1相比，转染miR-873mimics+pcDNA3.1后，活细胞数显著减少，细胞增殖率降低，PCNA表达降低（P＜0.05）;而与转染miR-873mimics+pcDNA3.1相比，转染miR-873mimics+pGLI1后，活细胞数显著增多，细胞增殖率升高，PCNA表达升高(P＜0.05)，提示miR-873过表达通过靶向GLI1基因而抑制心肌细胞增殖。
　　10、miR-873过表达通过靶向GLI1基因而使细胞周期阻滞于G1期。与转染Negative Control+pcDNA3.1相比，转染miR-873mimics+pcDNA3.1后，S期细胞数显著减少，Cyclin E1表达降低(P＜0.05);而与转染miR-873mimics+pcDNA3.1相比，转染miR-873mimics+pGLI1后，S期细胞数显著增多，Cyclin E1表达升高(P＜0.05)，提示miR-873过表达通过靶向GLI1基因而使细胞周期阻滞于G1期。
　　结论:
　　1、GLI1基因是miR-873的靶基因之一。
　　2、miR-873靶向负调控GLI1基因表达。
　　3、miR-873过表达能够抑制心肌细胞增殖，使细胞周期阻滞于G1期。
　　4、miR-873通过靶向GLI1基因而参与心肌细胞增殖，影响细胞周期。
　　5、miR-873在CHD患者外周血清中表达升高，具有一定的临床诊断价值。

目录

声明

摘要

英文缩略语

第一部分：miR-873调控GLI1基因表达的功能鉴定

1 前言

2．1 标本

2．2 细胞株、菌株和载体

2．3 相关分子生物学实验材料

2．4 实验仪器

2．5 国际生物学信息途径和计算机分析软件包

2．6 实验方法

3 结果

3．1 miR-873与GLI1 3’-UTR靶向结合

3．2 miR-873负调控内源性GLI1基因表达

3．3 心肌组织中miR-873与GLI1基因表达呈负相关

4 讨论

第二部分 miR-873靶向调控GLI1基因在先天性心脏病中的作用机制

5 前言

6．1 标本

6．2 细胞株、菌株和载体

6．3 相关分子生物学实验材料

6．4 实验仪器

6．5 国际生物学信息途径和计算机分析软件包

6．6 实验方法

7 实验结果

7．1 CHD患者外周血清miR-873表达升高

7．2 miR-873过表达能够抑制心肌细胞增殖

7．3 miR-873过表达使细胞周期阻滞于G1期

7．4 miR-873过表达不影响心肌细胞凋亡

7．5 miR-873过表达不影响心肌细胞自噬

7．6 miR-873过表达通过靶向GLI1基因而抑制心肌细胞增殖

7．7 miR-873过表达通过靶向GLI1基因而使细胞周期阻滞于G1期

8 讨论

9 结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 microRNA在心脏发育和心血管疾病中的研究进展

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

个人简历