左氧氟沙星联合亚胺培南对铜绿假单胞菌慢性肺部感染免疫低下大鼠抗菌作用及耐药机制研究

摘要

目的:建立铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)慢性肺部感染合并免疫低下大鼠模型，研究免疫因素对PA治疗的影响;探讨左氧氟沙星(Levofloxacin，LVF)单独应用、同时与亚胺培南/西司他丁(Imipenem/cilastatin，IPM/CS)联合应用对PA慢性肺部感染的治疗作用，并对相关耐药机制进行分析研究。
　　方法:
　　第一部分:铜绿假单胞菌慢性肺部感染合并免疫低下大鼠模型的建立
　　应用临床常见的化疗药物环磷酰胺(Cytoxan，CTX)，以40 mg/kg给药剂量，连续三日予以腹腔注射，通过气管插管法将PA藻酸盐包被体注入大鼠肺组织，建立肺部感染模型。模型建立后每7日给予大鼠相同剂量的CTX，维持大鼠免疫抑制状态。在模型建立期间，固定时间检测大鼠肺载菌量、肺部病理学变化等指标，同时对外周血血常规、T细胞亚群等免疫学指标进行检测。
　　第二部分:左氧氟沙星、亚胺培南单药及联合给药对铜绿假单胞菌慢性肺部感染免疫力低下大鼠药效学研究
　　采用第一部分方法，建立铜绿假单胞菌慢性肺部感染免疫低下大鼠模型。将模型组大鼠随机分为三个实验组，分别予以LVF45 mg/kg口服灌胃、IPM90 mg/kg腹腔注射、LVF45 mg/kg口服灌胃联合IPM90 mg/kg腹腔注射，并设立对照组。实验期间，对大鼠肺部病理学、免疫学等指标进行检测，收集所产生的耐药菌株。
　　第三部分:铜绿假单胞菌体内药效学耐药机制研究
　　采用PCR等分析方法，对各组各时间点PA耐药菌株，对喹诺酮类药物耐药决定区(Quinolone resistance determining region，QRDR)区域突变位点、质粒介导耐药及OprD2孔道蛋白等指标进行分析。从分子机制角度对体内分离PA耐药株做出进一步分析。
　　结果:
　　第一部分:铜绿假单胞菌慢性肺部感染合并免疫低下大鼠模型的建立
　　模型建立后，大鼠产生了不同程度的食欲下降、体重减轻、行动力迟缓等症状，并有弓背、脱毛、血便、鼻部与眼眶周围出血结痂等现象。HE染色结果显示，模型组大鼠在造模成功后肺部产生病理学病变，肺组织有较明显的充血水肿、中性粒细胞聚集等现象。同时，血常规结果显示，模型组白细胞数目有所下降(p＜0.05)，外周血中性粒细胞有不同程度的增高，T细胞亚群CD4+/CD8+等值有所升高(p＜0.05)。参照国内外相关文献，判断模型成功建立。
　　第二部分:左氧氟沙星、亚胺培南单药及联合给药对铜绿假单胞菌慢性肺部感染免疫力低下大鼠药效学研究
　　模型组大鼠给药后，鼻周液体分泌物显著减少、状态有不同程度恢复，肺组织病理呈不同程度的改善。耐药株分离率大体上随给药时间增长而增加，并于给药后21天达到峰值，停药后有所降低。与LVF单药给药组相比，LVF联合IPM给药组耐药菌株产生率显著降低(p＜0.05)，同时治愈率显著升高(p＜0.05)。
　　第三部分:铜绿假单胞菌体内药效学耐药机制研究
　　LVF组耐药菌株中给药6天后发现质粒介导耐药基因QnrA，给药12天后发现质粒介导耐药基因QnrB，同时随着给药时间延长，耐药株质粒介导耐药基因分离频数与频率呈现不同程度的升高，停药后分离有所下降。IPM给药组于第6、15天检测到MBL，联合组耐药株样本未检测出MBL阳性;OprD2孔道蛋白缺失是本实验PA对IPM耐药的主要因素，通过此部分实验结果，联合给药组OprD2基因缺失数目明显低于IPM给药组(P＜0.05)。
　　结论:参照国内外文献，本实验成功建立了PA慢性肺部感染免疫低下大鼠模型;基于该模型的研究中，LVF、IPM给药组有效率较低、耐药率高;联合给药组有效率高、耐药率低;同时，随给药时间延长，耐药率显著增加，并于停药后下降。其中，QnrA、QnrB、VIM-1型MBL及OprD2孔道蛋白缺失为PA对两种药物的主要耐药形式，各组给药12d即达到较高的检出水平，停药后有所降低。

目录

声明

摘要

英文缩略语

第一部分：铜绿假单胞菌慢性肺部感染合并免疫低下大鼠模型的建立

1 前言

2．1 主要试剂和仪器

2．2 实验分组及实验方法

2．3 指标的记录与检测

2．4 PA慢性肺部感染大鼠模型成功的检验标准

2．5 统计学分析

3 结果

4 讨论

第二部分：左氧氟沙星、亚胺培南单药及联合给药对铜绿假单胞菌慢性肺部感染免疫力低下大鼠药效学研究

1 前言

2．1 主要试剂和仪器

2．2 实验方法

3 结果

4 讨论

第三部分：铜绿假单胞菌体内药效学耐药机制研究

1 前言

2．1 主要试剂和仪器

2．2 实验方法

3 结果

4 讨论

全文结论

本研究创新性自我评价

参考文献

综述 β-内酰胺类联合氟喹诺酮类抗菌药治疗铜绿假单胞菌感染机制研究进展

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

个人简历