碱蓬内生真菌JP4-1的筛选、鉴定及促生活性研究

摘要

植物内生真菌是指生活于健康植物组织和器官内部，而不使植物患病的真菌。植物内生真菌在宿主的代谢、发育和进化过程中发挥着重要作用，其次生代谢产物具有多种生物学活性，如促进植物生长，增强其抗逆、抗病能力等，已成为发现新的活性先导化合物的重要来源。碱蓬（Suaeda salsa）是生长于高盐碱土壤中的一种特殊植物，从这种植物体内分离得到的内生菌具有丰富的多样性且多为可以生存于盐碱特殊环境的极端微生物，这种极端微生物一般具有与其宿主所处的生长环境相适应的特殊代谢机制，能产生独特的活性代谢产物，并对宿主产生一定的影响。研究碱蓬内生真菌、分析其促生活性代谢产物，追踪内生真菌的定殖特性，对于开发和利用碱蓬内生真菌资源，探索内生真菌与宿主植物间的互作机制具有重要意义和潜在的应用价值。
　　本研究通过水培法对已分离得到的5株碱蓬内生真菌进行筛选，以其中对水稻幼苗最具促生活性的 JP4-1为实验菌株，采用形态学鉴定和分子生物学鉴定相结合的方法对该菌株进行鉴定；通过单因素实验和正交实验确定其最佳发酵培养基和培养条件；运用过滤离心、超声破碎、萃取、旋蒸等技术手段研究该菌株发酵液对水稻幼苗的促生长活性成分。采用 PEG-CaCl2介导的原生质体转化法对 JP4-1菌株进行绿色荧光蛋白（GFP）标记和定殖特性的初步研究，主要研究结果如下：
　　1.水培试验证明：实验选取的5株碱蓬内生真菌对水稻幼苗均具有一定的促生作用，其中菌株JP4-1促生效果最为明显。
　　2.根据对菌株 JP4-1的形态学观察和分子生物学鉴定，可将其归属为小丛壳属（Glomerella sp.）。
　　3.单因素试验和正交试验表明，菌株 JP4-1的最佳发酵条件是：以土豆液体培养基为基础，蔗糖4％，硫酸铵0.15%，氯化钾0.02%，磷酸氢二钾0.2%，pH5.0，培养温度25℃，装液量为50%，125 rpm发酵120 h。
　　4.运用过滤离心、超声破碎、萃取、旋蒸等技术手段和水培法探究 JP4-1菌株发酵液对水稻幼苗的促生长活性成分的结果表明，以正丁醇提取的该菌株胞外小分子萃取物可使水稻幼苗的株高和干重分别提高10.84%和14.67%，叶绿素总量提高44.22%，促生长作用最为显著。JP4-1菌株发酵液的正丁醇萃取成分的液相色谱分析表明其中含有赤霉素（GA）、生长素（IAA）、脱落酸（ABA）等促进植物生长的激素成分。
　　5.利用PEG-CaCl2介导的原生质体转化方法，将gfp基因转入菌株JP4-1原生质体内并再生，得到可稳定遗传的转化子。转化子侵染水稻幼苗的示踪结果表明：碱蓬内生真菌JP4-1菌株定殖于水稻幼苗根、叶的细胞间隙并具有一定的运动性。

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第一章 引言

1.1 植物内生菌概述

1.2本研究目的意义、主要研究内容、技术路线和创新点

1.3 课题来源

第二章 促生活性碱蓬内生真菌的筛选

2.1 材料

2.2 方法

2.3 结果与分析

2.4 结论与讨论

第三章 碱蓬内生真菌JP4-1菌株的鉴定及发酵条件优化

3.1 材料

3.2 方法

3.3 结果与分析

3.4 结论与讨论

第四章 菌株JP4-1促生活性成分的筛选与测定

4.1 材料

4.2 方法

4.3 结果与分析

4.4 结论与讨论

第五章 JP4-1菌株的gfp基因转化及其定殖的初步研究

5.1 材料

5.2方法

5.3 结果与分析

5.4 结论与讨论

结论

参考文献

个人简历

致谢