产生Ⅱ型聚酮类化合物的放线菌活性菌株筛选

摘要

聚酮类化合物是一类由微生物产生的次级代谢产物,具有良好的抑菌活性,已被广泛开发应用。现今已发现的天然聚酮类化合物超过10,000种,很多重要的抗生素、免疫抑制剂、抗肿瘤药物、生物农药等都属于聚酮类家族。聚酮类化合物被广泛应用于工业、农业、医药卫生领域,与人类生产生活密切相关。放线菌是聚酮类化合物的主要产生菌,已知的天然聚酮类化合物中有70％来源于放线菌,因此,为了筛选产生聚酮类化合物的放线菌菌株,人们从自然界中分离培养放线菌,进行发酵条件的优化,得到具有生物活性的次生代谢产物。然而,这种传统方法分离出的化合物与已知化合物的重复率很高,于是,基于活性代谢产物的合成基因开展微生物的定向筛选方法越来越受到人们的青睐。
　　 已知的聚酮类化合物生物合成途径是由简单羧酸如乙酸、丙酸或丁酸在聚酮合酶(polyketide synthase,PKS)的作用下连续脱羧缩合而成,很多已被克隆的聚酮类化合物生物合成基因簇显示,聚酮合酶(PKS)基因簇中的酮基合成酶(ketoacyl synthase,KS)基因具有一定的保守性。据此,本实验设计Ⅱ型KS基因简并引物,以实验室分离保藏的土壤放线菌的基因组DNA为模板,扩增KS基因片段。本论文从58株未知土壤放线菌菌株中筛选出携带Ⅱ型KS基因的放线菌菌株38株,克隆并测序获得38个核苷酸序列,BLAST在线比对结果表明,其中35个序列均为Ⅱ型KS基因序列。经过系统发育分析发现,携带Ⅱ型KS基因的35个菌株中,菌株HVG60、T12-218、GT1H、T1、MY09、MY01的KS基因明显不同于已知的KS基因,且在系统发育树上独立分支。6株放线菌的抑真菌活性检测结果表明,菌株GT1H和HVG60抑真菌活性较高。利用16S rDNA对菌株GT1H和HVG60进行分类鉴定,结果表明菌株GT1H为利尻链霉菌(Streptomycesrishiriensis),菌株HVG60为橄榄产色链霉菌(Streptomyces olivochromogenes)。利尻链霉菌产生的生物活性物质香豆霉素(coumermycin A1)不具有抗真菌活性,而GT1H却具有抗真菌活性,说明菌株GT1H与利尻链霉菌不完全相同；橄榄产色链霉菌没有关于活性代谢产物的报道。所以菌株GT1H和HVG60很可能代谢产生一种新型化合物,有深入研究的价值,可作为进一步开发的备选菌株。
　　 本研究成功地从58株未知放线菌中初步筛选出了2株具有产生新型聚酮类化合物潜能的活性菌株,建立了一种快速、高效的筛选体系,为新型聚酮类化合物的筛选提供了前提,有助于人类更好的开发利用自然环境中的微生物资源。

目录

文摘

英文文摘

1 绪论

1.1 聚酮类化合物简介

1.1.1 聚酮类化合物的应用

1.1.2 聚酮类化合物的分类

1.2 聚酮类化合物的生物合成

1.2.1 聚酮合成酶

1.2.2 聚酮合成酶编码基因

1.3 聚酮合成酶基因的克隆

1.3.1 聚酮合成酶基因特点

1.3.2 基因克隆方法

1.3.3 基因克隆原理简介

2 携带Ⅱ型KS基因菌株的筛选

2.1 材料与方法

2.1.1 实验材料

2.1.2 实验方法

2.2 结果与分析

2.2.1 放线菌基因组DNA的提取方法比较

2.2.2 温度梯度PCR反应结果

2.2.3 PCR筛选Ⅱ型KS基因阳性菌株结果

2.3 讨论

2.3.1 放线菌基因组DNA的提取

2.3.2 携带Ⅱ型KS基因的放线菌菌株筛选

3 Ⅱ型KS基因的克隆与系统分析

3.1 材料与方法

3.1.1 实验材料

3.1.2 实验方法

3.2 结果与分析

3.2.1 感受态细胞的制备与验证

3.2.2 PCR产物回收纯化结果

3.2.3 质粒提取结果

3.2.4 重组克隆的PCR结果

3.2.5 测序结果与分析

3.3 讨论

4 抗真菌活性菌株的筛选与分类鉴定

4.1 材料与方法

4.1.1 实验材料

4.1.2 实验方法

4.2 结果与分析

4.2.1 活性检测结果

4.2.2 GT1H和HVG60 16S rDNA序列测定结果

4.3 讨论

结论

参考文献

附录 A 实验获得的KS基因序列

附录 B 菌株GT1H和HVG60的16S rDNA序列

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致谢