日本七鳃鳗中MHCⅡB基因的克隆、表达与生物信息学分析

摘要

七鳃鳗作为脊椎动物最直接的祖先,为探索脊椎动物适应性免疫演化提供了丰富的遗传信息。对七鳃鳗免疫基因的研究为我们了解适应性免疫的起源与演化提供了参考。主要组织相容性复合体(Maior Histocompatibility Complex,MHC)是脊椎动物中发现的编码免疫球蛋白样受体(Immunoglobulin-like receptors)的重要的非特异性免疫基因之一。MHC可分为MHCⅠ、MHCⅡ和MHCⅢ等三类,MHCⅡ是由α链和β链非共价键组成的编码细胞表面糖蛋白的异源二聚体,有两种亚型A和B,MHCⅡB基因编码的β1和β2区的第2和第3个外显子及两个外显子之间的内含子,具有高度多态性,在免疫应答中起重要的调控作用,同时对于抗病性研究具有重要意义。目前关于MHC的研究主要集中在硬骨鱼及哺乳动物,七鳃鳗中是否存在MHC尚不明确。本论文利用分子生物学手段和生物信息学方法,首次从日本七鳃鳗(Lampetra japonica)白细胞中获得了MHCⅡB基因片段,对其基因进行克隆、表达和生物信息学分析,有助于揭示七鳃鳗MHCⅡB基因与无脊椎动物和脊椎动物间的适应性免疫进化关系,同时为进一步阐述脊椎动物MHCⅡ家族的起源和进化提供了理论依据。
　　 本研究运用RACE,半定量RT-PCR,生物信息学等技术,以草鱼为克隆对照组,首次成功克隆获得日本七鳃鳗(Lampetra japonica)非特异性免疫因子MHCⅡB基因,cDNA序列全长为1209bp,含有3’UTR、启动子、多肽结合区(β1)、IGC区(β2)、跨膜区、胞质区和5’UTR区,编码区大小为834bp,分别编码277个氨基酸。氨基酸序列分析发现日本七鳃鳗MHCⅡB分子具有经典MHC蛋白分子的空间结构,属于alpha+beta型蛋白。β1区含有糖基化位点(NST)；酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点；在β1、β2及跨膜区都含有豆蔻酰化位点。
　　 此外,与24个不同物种的MHCⅡB氨基酸序列进行比对分析,构建了脊椎动物的系统进化树,结果表明日本七鳃鳗MHCⅡ B的氨基酸序列拥有经典MHCⅡB结构形成所需的半胱氨酸,并且该分子的β2区氨基酸序列可以作为研究脊椎动物物种间进化关系的良好标记。并应用半定量RT-PCR检测方法对七鳃鳗的MHCⅡB基因表达特点进行了分析,结果显示在鳃、心脏、血液中高表达,在肾脏有少量表达,在皮肤,肌肉,肝脏,肠,性腺,均不表达。
　　 结论:无颌类日本七鳃鳗MHCⅡB基因的发现,为我们更好了解适应性免疫系统的起源和进化提供了线索。同时为探索MHCⅡB基因的进化机制奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

1 绪论

1.1 七鳃鳗适应性免疫研究进展

1.1.1 细胞受体CD分子

1.1.2 可变淋巴受体(VLRs)

1.1.3 类胸腺的发现

1.1.4 七鳃鳗推动脊椎动物颌骨演化新进展

1.2 主要组织相容性复合体研究概述

1.2.1 MHC的构成及功能

1.2.2 MHC基因的多样性

1.2.3 MHC基因与抗病性关系

1.3 MHCⅡ类分子进化概述

1.3.1 MHCⅡ类分子结构组成

1.3.2 MHCⅡ类分子进化机制

1.3.3 MHCⅡ分子多态性维持机制

1.3.4 MHCⅡ分子与CD4'细胞的作用

1.3.5 MHCⅡB基因组织表达分析

1.4 MHCⅡ基因的应用

1.4.1 MHC Ⅱ基因在保护遗传学中的应用

1.4.2 MHCⅡ基因在异种移植排斥中的作用

1.5 本研究的目的、方法和意义

1.5.1 研究目的及方法

1.5.2 研究意义

2.日本七鳃鳗主要组织相容性复合体的MHC Ⅱ B基因克隆

2.1 材料和方法

2.1.1 材料

2.1.2 白细胞的分离

2.1.3 总RNA的提取

2.1.4 设计兼并引物扩增保守序列

2.2 cDNA全序列的扩增反应

2.2.1 CDS区中间片段区的扩增反应

2.2.2 cDNA3’末端快速扩增反应(3’RACE)

2.2.3 cDNA 5’末端快速扩增反应(5'RACE)

2.2.4 RACE所得的片段序列拼接

2.3 结果

2.3.1 日本七鳃鳗白细胞的总RNA提取

2.3.2 以草鱼为对照克隆目的片段实验结果

2.3.3 MHC ⅡB基因全长扩增

2.4 讨论

2.4.1 七鳃鳗MHCⅡB基因的获得

2.4.2 RACE扩增实验中的注意事项

2.5 小结

3 日本七鳃鳗MHCⅡB基因生物信息学分析

3.1 材料与方法

3.2 结果

3.2.1 氨基酸序列分析

3.2.2 氨基酸理化性质及序列组成分析

3.2.3 功能结构域预测

3.2.4 氨基酸序列跨膜结构域预测

3.2.5 信号肽结构预测

3.2.6 二级结构的预测和分析

3.2.7 三级结构的预测和分析

3.2.8 日本七鳃鳗与其他物种的序列比对

3.2.9 分子系统发育分析

3.3 讨论

3.4 小结

4 日本七鳃鳗MHC Ⅱ B基因组织表达特征分析

4.1 半定量RT-PCR方法的检测

4.1.1 提取组织和细胞中的总RNA

4.1.2 cDNA第一链的合成

4.1.3 七鳃鳗管家基因GAPDH引物合成及电泳检测cDNA第一链

4.1.4 半定量RT-PCR扩增

4.1.5 半定量RT-PCR扩增结果

4.2 讨论

4.2.1 MHC ⅡB基因组织表达比较

4.2.2 半定量RT-PCR实验中注意事项

4.3 小结

5 结论

本论文的创新点

参考文献

附录 A 中间序列

附录 B 日本七鳃鳗MHCKB-like基因mRNA全序列

附录 C 日本七鳃鳗MHCIIB-like基因CDS区序列

附录 D 日本七鳃鳗MHCIIB-Iike基因CDS区翻译后的氨基酸序列

附录 E 不同物种的MHCIIB基因的FASTA格式氨基酸序列

附录 F 七鳃鳗与不同物种MHCIIB基因的比对相似性

研究生期间发表文章及研究成果

致谢