载体形貌与酶底物种类对介孔碳CMK-3固载辣根过氧化物酶性能的影响

摘要

在顺序注射系统内根据介孔材料孔径和生物大分子的尺寸相当的特点，将酶固定于介孔碳材料孔道中，实现酶功能化介孔碳的高效在线制备，从而快速筛选酶适宜的固定化载体材料。利用系统原位检测能力，在酶功能化介孔碳材料制备过程中对其进行多元多参数的实时性能评价，完成酶促反应中色原底物的特异性选择。基于上述目标，本文以三种不同形貌介孔碳CMK-3作为酶固定化载体，以辣根过氧化物酶为研究对象，愈创木酚、邻苯二胺和焦酚为色原底物，利用顺序注射-紫外可见分光系统，开展了以下两方面的研究：
　　 1.介孔碳CMK-3形貌对负载辣根过氧化酶性能的影响
　　 利用顺序注射-紫外可见分光系统，研究了短棒、长棒和盘状三种不同形貌介孔碳材料对辣根过氧化酶的在线吸附能力及吸附机理，并实时评价了固定化HRP的活性及稳定性。通过氮吸附实验以及扫描电镜，进一步证实HRP不仅能吸附于CMK-3的表面，而且能进入孔道内，从而增强固定化HRP的活性稳定性和操作稳定性。结果还表明短棒形貌CMK-3聚集酶的能力、疏水能力以及结合能力要远远优于长棒和盘状介孔碳材料，且固定化酶的活性高、稳定性好。
　　 2.以介孔碳CMK-3为载体的固定化辣根过氧化酶色原底物的特异性选择
　　 选择HRP常见的色原底物愈创木酚、邻苯二胺和焦酚，利用顺序注射-紫外可见分光系统，评价了HRP/CMK-3的底物特异性并对产生这种特异性的机理进行探讨。结果表明不同的底物及其催化产物在CMK-3上存在不同的吸附作用：愈创木酚本身在载体止有强烈的吸附且其产物的笼状结构影响以介孔材料为载体的固定化酶的催化活性；邻苯二胺在载体有吸附但吸附到一定程度后仍可较好的保持固定化酶的活性；焦酚在载体止无吸附并可以直接参与固定化酶的催化反应。以邻苯二胺和焦酚为生色底物对固定化酶催化H2O2活性进行评价，酶与底物焦酚的亲和性较强，米式常数Km=1.27mmol/L。研究结果证实酶催化底物的选择是合理评价固定化酶载体性能的重要影响因素。

目录

文摘

英文文摘

1 绪论

1.1 介孔材料简介

1.1.1 介孔材料的定义和分类

1.1.2 介孔材料的表征

1.1.3 介孔材料的应用

1.2 介孔材料-酶相互作用的影响因素

1.2.1 介孔材料-酶相互作用方法

1.2.2 酶分子的大小以及介孔材料孔径孔道

1.2.3 载体形貌的影响

1.2.4 合成有序介孔材料模板剂的影响

1.2.5 酶的等电点和溶液的pH值的影响

1.2.6 载体改性的影响

1.2.7 扩散阻力的影响

1.3 顺序注射在线酶固定化及实时评价系统

1.3.1 顺序注射技术

1.3.2 顺序注射在生物亲和作用以及生物活性物质在线检测方面的应用

1.3.3 顺序注射在线酶固定化及实时评价系统

1.4 本论文的工作思路和研究目标

2 介孔碳CMK-3形貌对负载HRP性能的影响

2.1 引言

2.2 实验部分

2.2.1 仪器与试剂

2.2.2 顺序注射-紫外可见分光系统

2.2.3 实验方法

2.3 结果与讨论

2.3.1 HRP在三种不同形貌介孔碳CMK-3上的固定化

2.3.2 三种不同形貌介孔碳CMK-3的表征

2.3.3 HRP/CMK-3/PVC的表征

2.3.4 吸附性能评价

2.4 结论

3 HRP/CMK-3色原底物的特异性选择

3.1 引言

3.2 实验部分

3.2.1 实验原理

3.2.2 仪器与试剂

3.2.3 HRP在线固定化及活性实时评价系统

3.2.4 实验方法

3.3 结果与讨论

3.3.1 介孔碳CMK-3对HRP吸附行为

3.3.2 不同色原底物种类对HRP/CMK-3催化活性影响

3.3.3 探讨HRP/CMK-3催化反应适宜的色原底物

3.3.4 HRP催化不同的色原底物机理讨论

3.3.5 酶促反应动力学研究

3.3.6 固定化酶柱的稳定性

3.4 结论

结 论

参考文献

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致谢