七鳃鳗Lck-like的克隆表达及生物信息学分析

摘要

Lck(Lymphocyte-specific protein tyrosine kinase)是在生物体中广泛表达的一类重要的SRC家族蛋白络氨酸激酶，是TCR(T细胞受体)下游激活的第一级信号分子，参与信号转导过程中蛋白质分子的磷酸化作用。研究显示，Lck对于介导TCR信号转导过程及细胞的发育、分化、增殖和激活具有十分重要的作用。七鳃鳗作为无脊椎动物向脊椎动物过渡物种，是脊椎动物免疫系统起源与进化研究的新型模式生物。目前对Lck的研究主要集中在高等脊椎动物，而对于相对比较原始的无颌类脊椎动物中，Lck的存在与否及有什么生物学作用尚不明确。
　　 本论文对实验室前期构建好的日本七鳃鳗(Lampetra japonica)血液cDNA文库中的3300多条有效EST序列进行搜索，发现一条与Src家族基因具有高度序列同源性的EST序列，将此序列通过对其进行同源序列比对分析，发现其与雷氏七鳃鳗的Src-like基因的ORF区3’末端序列同源性较高。根据该基因的结构特点设计引物，通过3’末端快速扩增和5’末端快速扩增实验，并对所得测序结果进行分析和拼接，成功得到了七鳃鳗Lck-likec DNA全长序列。将其与从低等到高等不同进化阶段的物种的Lck氨基酸一级序列进行比对分析，基于邻接法等构建了系统发育树。此外，还对其进行二级结构域模拟分析，三级结构域预测，亲疏水性预测，二硫键预测，抗原表位预测及保守基序的分布预测。
　　 利用Real Time PCR检测方法，自行设计特异性引物并以GAPDH作为内参基因，对Lck-like在对照组和脂多糖(LPS)刺激组的七鳃鳗心脏、脂肪小体、肾脏、肠、肝脏、鳃和白细胞中的相对表达量进行分析，结果显示在未刺激时，Lck-like在七鳃鳗上述组织中广泛表达，当进一步经LPS刺激后，Lck-like在以上所有组织中的表达量都有所上调，在白细胞中的表达量明显上调，在脂肪小体和鳃中的表达量也有所上升，均具有统计学意义。由此表明Lck-like在参与七鳃鳗适应性免疫系统信号转导过程中发挥着至关重要的作用。
　　 进一步构建pGEX-4T-1-Lck-like原核表达载体，并成功在E.coli BL21中进行表达。
　　 结论：现存最古老的无颌类脊椎动物七鳃鳗中Lck-like的发现，有助于从分子水平上深入探索脊椎动物中Lck蛋白的起源与进化及由Lck介导的七鳃鳗信号转导通路，为我们更好了解原始脊椎动物适应性免疫系统的起源和进化提供了线索。