七鳃鳗(Lampetra japonica)CD81的克隆表达及生物信息学分析

摘要

CD81属于四跨膜蛋白超家族(transmembrane4 superfamily，TM4SF)成员，广泛表达于不同的组织中，可促进细胞自身和细胞之间的信号转导并能跨膜作用于某些蛋白。CD81可以参加几种病毒辨认与进入细胞，调节不同细胞的一系列生理反应过程。此外，CD81是B细胞和T细胞受体的组成成分，它们之间的相互作用会抑制信息的传递[1]。当前研究的主要内容是CD81在B-T细胞彼此作用中所起到的作用，以及分别在B细胞和T细胞中发挥的功能[2]。CD81在细胞膜上可与CD4、CD8、CD19、CD21、HLA-DR和α3β1整合素等结合，并调控丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)对宿主细胞的侵染，通过免疫作用刺激产生的CD81抗体能有效的阻止HCV的侵染和传播等[3]。目前的研究主要集中在高等脊椎动物，但在相对原始的无颚脊椎动物七鳃鳗中CD81的生物学功能还不清楚。 在本文中，通过对脂肪体cDNA文库中的cDNA序列进行查找与生物信息学分析（此文库为本实验室构建的日本七鳃鳗（Lampetra japonica）文库），得到一条与已报道的哺乳动物CD81有较高同源性的序列，它能够翻译CD81蛋白的开放阅读框。以此序列信息为基础而设计引物并添加酶切位点，随后以日本七鳃鳗脂肪体的总RNA作为模板，运用PCR扩增方法得到702bp的七鳃鳗CD81目的片段，并且构建pET42a(+)-CD81原核表达载体成功。将得到的七鳃鳗CD81氨基酸序列与其它不同物种中的CD81氨基酸序列比对分析后构建系统发育树。此外，还对其进行二级结构域模拟分析，三级结构域预测，亲疏水性预测，二硫键预测，抗原表位预测及保守基序的分布预测等。 我们利用半定量PCR方法，检测CD81在七鳃鳗白细胞、肾脏、心脏、肝脏、鳃和脂肪体对照组和灭活菌刺激组中的相对表达量，并分析对照组和刺激组CD81表达水平的变化情况。 结论:七鳃鳗介于脊椎动物和无脊椎动物的中间位置，在其中CD81的发现，有助于深入探索CD81对七鳃鳗造血系统的调节机制以及脊椎动物中CD81蛋白的起源和进化，是更好地了解原始脊椎动物的造血系统和免疫调节过程的基础。

目录

声明

摘要

1 绪论

1．1 CD81的结构

1．1．1 胞外区

1．1．2 跨膜区

1．1．3 胞内区

1．2 CD81对B细胞的作用

1．3 CD81对T细胞的作用

1．4 CD81与软脂酰化

1．5 结语

2 七鳃鳗CD81的分子克隆

2．1 材料

2．1．1 实验材料

2．1．2 仪器设备

2．1．3 药品及试剂

2．2 方法

2．2．1 七鳃鳗的造血组织研究

2．2．2 脂肪体总RNA的提取

2．2．3 引物设计

2．2．4 逆转录-聚合酶链式反应扩增

2．2．5 CD81目的片段的切胶回收

2．2．6 CD81目的片段与载体的连接和转化

2．2．7 重组质粒的鉴定

2．2．8 重组质粒的提取及测序

2．2．9 实验所得的序列分析

2．3 结果

2．3．1 脂肪体组织总RNA的提取

2．3．2 CD81目的片段扩增

2．4 讨论

2．5 小结

3 CD81氨基酸序列的生物信息学分析

3．1 分析和预测CD81蛋白的网站和软件

3．2 结果

3．2．1 一级结构分析

3．2．2 功能结构域预测

3．2．3 二级结构的预测

3．2．4 三级结构模拟

3．2．5 抗原表位预测

3．2．6 同源序列比对

3．2．7 保守性的分析

3．2．8 系统发育的分析

3．3 讨论

3．4 小结

4 半定量PCR法检测CD81在七鳃鳗各组织中的相对表达量

4．1 材料

4．1．1 实验材料

4．1．2 实验所用仪器设备

4．1．3 药品及试剂

4．2 方法

4．2．1 混合菌免疫七鳃鳗

4．2．2 白细胞的分离及组织提取

4．2．3 各组织和白细胞RNA的提取

4．2．4 利用半定量PCR法测定靶基因相对表达量

4．3 结果

4．3．1 组织总RNA的提取

4．3．2 CD81目的片段PCR

4．3．3 七鳃鳗各组织中CD81的相对表达量

4．4 讨论

4．5 小结

5 重组CD81载体的构建

5．1 材料

5．1．1 实验材料

5．1．2 仪器设备

5．1．3 药品及试剂

5．2 方法

5．2．1 设计引物

5．2．2 PCR扩增

5．2．3 目的片段回收

5．2．4 目的片段与载体相连与转化

5．2．5 重组表达菌的鉴定

5．3 结果

5．4 讨论

5．5 小结

6 结论

本论文的创新点

参考文献

附录A 脂肪体cDNA文库中和CD81有较高同源性的序列

附录B 成功克隆的七鳃鳗CD81目的片段

附录C CD81在不同物种中的氨基酸序列(FASTA格式)

研究生期间研究成果和发表文章

致谢