中华绒螯蟹蜕皮激素调节蛋白表达、纯化及鉴定

摘要

中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)，中国甲壳类动物重要养殖物种之一。目前，中华绒螯蟹的养殖业随着世界市场的需求逐渐成为我国一个重要的支柱产业，但由于中国水产养殖的密集化发展，使得养殖过程中中华绒螯蟹经常患上由各种病毒和细菌所引发的疾病以及出现大量性早熟和种质退化等现象，这些都已经对中华绒螯蟹的养殖业产生了重创，同时这些问题已经成为了该蟹养殖业停滞不前的瓶颈之一。在科研人员对中华绒螯蟹饲养条件改良后其产量效果仍不佳的情况下，研究人员开始从分子生物学的角度来对这些问题进行探讨研究。大量研究发现，中华绒鳌蟹体内的蜕皮激素参与了与蜕皮发育有关的各种活动，而与蜕皮激素有关的蜕皮激素调节蛋白被发现有可能参与了该蟹发育过程中的蜕皮级联反应。由于中华绒螯蟹中的性早熟和蜕皮未遂等现象与该蟹的蜕皮过程密切相关，因此研究该蟹的蜕皮相关基因对解决该蟹在养殖方面出现的问题有重要的意义。本次研究就试图从分子生物学的角度来对中华绒螯蟹中与蜕皮激素有关的蜕皮激素调节蛋白进行研究，以期能进一步深入了解中华绒螯蟹蜕皮过程的机理，解决养殖过程中的瓶颈问题以及进一步地推动我国中华绒螯蟹养殖业的稳定发展。
　　本次研究首次以GST融合蛋白的形式来克隆、表达以及纯化蜕皮激素调节蛋白。首先利用生物信息学软件对蜕皮激素调节基因进行序列分析，从理论上得知该基因的一些基本信息，包括该基因的cDNA序列分析、氨基酸序列分析、蛋白功能域预测以及基因编码的氨基酸的同源性比对和分子进化分析。在获知该基因以及该蛋白质的一些基本信息后，首先从中华绒螯蟹体内获得成熟的eDNA片段，然后运用PCR技术获得该基因的开放阅读框，之后通过目前世界上比较先进的同源重组技术获得一个可以有效表达融合蛋白的pGEX-4T-1-Esr重组质粒，在大肠杆菌中成功表达该蛋白后，再运用一系列纯化柱，包括GST亲和层析柱，Mono Q阴离子交换柱以及Hiload Superdex75分子筛等对此融合蛋白进行纯化。在纯化过程中，每个步骤都能去除掉大量的杂蛋白，在分子筛之后，基本获得了单一的蜕皮激素调节蛋白。之后，用聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检测到一个41KD大小的蛋白，然后用质谱来对此蛋白进行进一步的验证。重组蛋白运用快速蛋白质液相层析系统(FPLC)进行纯化。大约可以获得2.4 mg/l纯度超过90％的重组蛋白。
　　本次研究首次获得纯度超过90％的重组的蜕皮激素调节蛋白，为今后对蛋白功能进行深入的研究奠定了基础。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 中华绒螯蟹养殖近况及研究进展

1．1．1 中华绒螯蟹养殖近况

1．1．2 中华绒螯蟹研究进展

1．2 蜕皮激素调节蛋白的研究概述

1．2．1 蜕皮激素调节蛋白的发现

1．2．2 蜕皮激素调节蛋白的研究现状

1．3 本研究的目的及意义

1．3．1 研究目的

1．3．2 研究意义

2 实验材料和方法

2．1 蜕皮激素调节基因的生物信息学分析

2．2 蜕皮激素调节基因序列分析结果

2．2．1 蜕皮激素调节基因cDNA序列分析

2．2．2 蜕皮激素调节基因氨基酸序列分析

2．2．3 蜕皮激素调节蛋白功能域预测

2．2．4 蜕皮激素调节基因编码的氨基酸的同源性比对和分子进化分析

2．3 蜕皮激素调节蛋白的体外重组表达与纯化

2．3．1 实验用中华绒螯蟹

2．3．3 反转录

2．3．4 重组质粒的构建

2．3．5 重组蛋白的表达

2．3．6 重组蛋白的纯化

2．3．7 重组蛋白的检测

3 实验结果

3．1 RNA以及cDNA的检测

3．1．1 RNA检测

3．1．2 cDNA的检测

3．2 PCR扩增的检测

3．2．1 检测扩增得到的插入片段

3．2．2 检测扩增得到的载体片段

3．2．3 检测转化到感受态细胞Top10中的目的片段

3．3 重组蛋白表达的检测

3．3．1 小剂量表达的检测

3．3．2 大剂量表达的检测

3．4 重组蛋白纯化的检测

4 讨论

结论

参考文献

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致谢