七鳃鳗L--C3--like基因克隆、蛋白表达及相关免疫学研究

摘要

补体第三组分(The third complement component，C3)是血清中含量最为丰富的补体蛋白，功能上处于经典途径、甘露糖凝集素途径和旁路途径三条激活途径的启动汇合位置，被视为补体系统的核心分子，是连接天然免疫和适应性免疫的桥梁，在免疫防御、调控、病理中均发挥重要作用。在抗原抗体复合物或病原体的刺激下，通过级联反应，活化补体C3，随后在靶细胞表面形成膜攻击复合体，最终达到裂解靶细胞的目的。另外，补体C3分子及其裂解产物还有一系列调节免疫系统的功能。总体来说，补体C3分子在先天性免疫和适应性免疫系统中，都起着重要的作用。 七鳃鳗作为稀有的无颌类脊椎动物的代表，进化地位处于无脊椎动物与脊椎动物之间，其独特的进化地位及可变淋巴受体VLR介导的特殊的适应性免疫系统受到免疫学家的关注。曾有报道称七鳃鳗补体C3分子由三条链β、α、γ组成，但是，其一致性与哺乳类动物补体C3分子相比不到40％，关于七鳃鳗体内的补体C3相关的免疫学功能，也尚不明确，且七鳃鳗体内是否存在其他补体分子也是未知，由此，对于七鳃鳗是否存在真正意义的补体系统有诸多疑点。 为了研究所谓的七鳃鳗体内的补体C3分子是否等同于传统哺乳动物意义上的C3分子及其相关的免疫学功能特点，我们进行了类日本七鳃鳗(Lampetra japonica)补体C3（L-C3-like）分子开放阅读框全长及3'非编码区的基因cDNA克隆，获得全序列6274bp，其中开放阅读框全长5013bp，编码1671个氨基酸，针对前人命名的α链与γ链的连接区域设计引物扩增获得L-C3-like-2、经原核表达及蛋白纯化，纯化后的重组蛋白经质谱鉴定表达无误，进一步进行抗七鳃鳗补体L-C3-like-2的兔多克隆抗体的制备，利用自行制备的多克隆抗体对天然L-C3-like分子进行相关的免疫学研究，激光共聚焦实验对七鳃鳗L-C3-like分子进行亚细胞定位，流式细胞术方法检测到L-C3-like分子在免疫小体细胞中有表达，Real-time PCR和Western blot分别在转录水平和蛋白水平显示各组织的蛋白表达情况。免疫共沉淀证实L-C3-like分子与VLRB存在相互作用关系，血清学检测及靶细胞沉积实验印证L-C3-like功能。 本论文通过对七鳃鳗抗补体L-C3-like-2多克隆抗体的成功制备为相关免疫学功能的研究奠定基础，重新揭开最低等脊椎动物先天性及适应性免疫系统的研究篇章，为解决其起源与进化的谜团提供重要线索。

目录

声明

摘要

1 绪论

1．1 C3结构

1．1．1 C3基本结构

1．1．2 C3活化裂解

1．1．3 C3进化分析

1．2 C3功能

1．2．1 C3生物学活性

1．2．2 C3相关疾病

1．3 结语及研究意义

2 L-C3-like开放阅读框全长及3’非编码区的克隆、生物信息学分析

2．1 材料

2．1．1 实验材料

2．1．2 仪器设备

2．1．3 药品及试剂

2．2 方法

2．2．1 引物设计

2．2．2 七鳃鳗L-C3-like(片段一、片段二)序列的克隆

2．2．3 七鳃鳗L-C3-like(片段三)cDNA3’末端全长快速扩增反应(3’RACE)

2．2．4 七鳃鳗L-C3-like(片段一、片段二、片段三)扩增序列的切胶回收

2．2．5 目的片段与载体连接

2．2．6 E．coli DH5α感受态细胞的制备

2．2．7 连接载体的目的片段的转化

2．2．8 重组质粒的鉴定

2．2．9 重组质粒抽提与测序

2．2．10 3’RACE实验和开放阅读框所得的序列拼接

2．2．11 L-C3-like生物信息学分析软件及数据库

2．3 结果

2．3．1 分子克隆

2．3．2 生物信息学分析

2．4 讨论

2．5 小结

3 七鳃鳗L-C3-like-2片段的蛋白表达、纯化及质谱检测

3．1 材料

3．1．1 主要试剂

3．1．2 主要仪器

3．2 方法

3．2．1 引物设计

3．2．2 PCR扩增

3．2．3 目的片段切胶回收

3．2．4 目的片段与载体的连接与转化

3．2．5 原核重组蛋白的诱导表达

3．2．6 原核重组蛋白包涵体纯化

3．2．7 纯化的原核重组蛋白质谱检测

3．3 结果

3．4 讨论

3．5 小结

4 兔抗七鳃鳗L-C3-like-2多克隆抗体的制备及鉴定

4．1 材料

4．1．1 主要试剂

4．1．2 主要仪器

4．2 方法

4．2．1 兔抗L-C3-like-2多克隆抗体的制备及间接ELISA法检测

4．2．2 多克隆抗体的纯化

4．2．3 Western Blot及质谱对多克隆抗体的敏感性与特异性的检测

4．3 结果

4．4 讨论

4．5 小结

5 L-C3-like的七鳃鳗组织、细胞表达分析

5．1 材料

5．1．1 主要试剂

5．1．2 主要仪器

5．2 方法

5．2．1 Real-time PCR法检测L-C3-like转录水平组织相对表达量

5．2．2 Western blot分析各组织L-C3-like蛋白的表达

5．2．3 激光共聚焦L-C3-like在七鳃鳗髓免疫小体细胞的亚细胞定位

5．2．4 流式细胞分析(FACS)L-C3-like七鳃鳗免疫小体细胞的表达

5．3 结果

5．4 讨论

5．5 小结

6 L-C3-like与VLRB分子协同参与的免疫学活性研究

6．1 材料

6．1．1 主要试剂

6．1．2 主要仪器

6．2 方法

6．2．1 L-C3-like与VLRB免疫共沉淀实验

6．2．2 L-C3-like兔红细胞沉积实验

6．3 结果

6．4 讨论

6．5 小结

结论

本文创新点

参考文献

附录 七鳃鳗L-C3-like分子核苷酸及氨基酸序列

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

攻读硕士期间参与项目情况

致谢