鹰嘴豆芽素A对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌外排系统的抑制作用

摘要

主动外排系统是细菌产生多重耐药性的重要机制，它通过将进入胞内的抗生素泵出胞外，降低菌体内药物的有效浓度而使细菌耐药。外排抑制剂可以阻碍细菌对药物的外排作用，它通过与一些抗生素的联合使用来达到治疗目的且不易诱发细菌的抗药性。鹰嘴豆芽素A(Biochanin A)作为一种天然的鹰嘴豆异黄酮，具有外排抑制剂的活性，但其作用机制尚未见相关报道。本实验就鹰嘴豆芽素A抑制外排的作用机制进行了系统深入的研究，结果如下: (1)通过头孢西丁纸片扩散法和PCR等方法检测了5株临床分离的MRSA的耐药和外排表型以及基因型，筛选出一株含有外排系统的高耐药株MRSA41577作为下游实验菌株。 (2)通过微量肉汤2倍稀释法和体外杀菌实验测定了鹰嘴豆芽素A、环丙沙星以及二者联合使用时的MIC值与杀菌率，结果显示鹰嘴豆芽素A本身并无抑菌活性，但是与环丙沙星具有协同抑菌作用，推测鹰嘴豆芽素A可抑制MRSA41577对环丙沙星的外排作用。 (3)通过双平板法比较鹰嘴豆芽素A在环丙沙星含药平板与不含药平板抑菌圈大小的差异（以典型抑制剂利血平作为阳性对照），初步判断鹰嘴豆芽素A为外排泵抑制剂。 (4)通过荧光分光光度法测定鹰嘴豆芽素A对环丙沙星在菌体内蓄积量的影响，结果显示鹰嘴豆芽素A可显著地提高环丙沙星的蓄积量，在15min时比对照组增加了83％(p＜0.01)，证明鹰嘴豆芽素A是外排泵抑制剂，且其抑制外排的效果与利血平相当。 (5)通过Realtime PCR法检测鹰嘴豆芽素A对外排基因norA表达的影响，实验结果显示，鹰嘴豆芽素A可以使norA基因的相对表达量下降到正常水平以下，证明鹰嘴豆芽素A可以抑制norA基因的转录，进而减少norA外排蛋白的合成。 (6)通过SDS-PAGE电泳法和液相色谱质谱联用仪检测鹰嘴豆芽素A对外排蛋白的影响，发现27.9kDa的ABC转运体ATP结合蛋白的合成明显下降，表明鹰嘴豆芽素A可能也通过抑制ABC外排蛋白的合成来抑制细菌对药物的外排作用。

目录

声明

摘要

引言

1 文献综述

1．1 金黄色葡萄球菌的耐药机制

1．2 细菌外排系统的研究进展

1．3 外排抑制剂的研究进展

1．4 本文研究目的和意义

1．5 本文主要内容

2 金黄色葡萄菌耐药菌株的筛选与鉴定

2．1 实验材料

2．1．1 菌株来源

2．1．2 实验药品与试剂

2．1．3 培养基

2．1．4 主要实验器材

2．2 实验方法

2．2．1 MRSA表型的检测方法

2．2．2 MRSA外排系统的检测方法

2．2．3 MRSA基因型的鉴定方法

2．2．4 菌株的分子生物学鉴定

2．3 结果

2．3．1 MRSA表型的检测结果

2．3．2 MRSA外排系统的检测结果

2．3．3 耐药基因鉴定结果

2．3．4 菌株16S rDNA序列分析

2．4 小结

3 鹰嘴豆芽素A对外排系统的抑制作用

3．1 实验材料

3．1．1 供试菌株

3．1．2 培养基

3．1．3 主要药品与试剂

3．1．4 仪器与设备

3．2 实验方法

3．2．1 鹰嘴豆芽素A与环丙沙星的协同作用

3．2．2 鹰嘴豆芽素A对MRSA41577外排作用的影响

3．2．3 鹰嘴豆芽素A对环丙沙星在菌体内蓄积量的影响

3．2．4 鹰嘴豆芽素A对外排基因norA表达的影响

3．2．5 鹰嘴豆芽素A对外排蛋白的影响

3．2．6 数据处理

3．3 结果

3．3．1 鹰嘴豆芽素A与环丙沙星协同作用的测定结果

3．3．2 鹰嘴豆芽素A对MRSA41577外排作用的影响

3．3．3 鹰嘴豆芽素A对环丙沙星在菌体内的蓄积量的影响

3．3．4 鹰嘴豆芽素A对外排基因norA表达的影响

3．3．5 鹰嘴豆芽素A对外排蛋白的影响

3．4 讨论

4 结论与展望

4．1 结论

4．2 有待深入研究的内容

4．3 本研究创新之处

参考文献

研究生期间学术论文发表情况

致谢