七鳃鳗组织蛋白酶D的克隆表达及生物信息学分析

摘要

组织蛋白酶D(cathepsin D，CTSD)是真核细胞溶酶体中天冬氨酸水解酶家族的主要成员，广泛参与蛋白质的水解过程。近年的研究发现，CTSD在多种生理（细胞增殖、细胞凋亡、细胞衰老和组织内稳态）和病理（阿尔茨海默病、动脉粥样硬化、先天性肌肉萎缩和癌症）条件中均发挥重要作用，并因其生物学功能的多样性而受到广泛关注。成体七鳃鳗主要营半寄生生活，以吸食宿主血肉为生，因其作为连接脊椎动物与无脊椎动物间的纽带而具有极高的研究价值。长久以来，七鳃鳗不仅是研究脊椎动物起源与进化的关键物种，同时也是研究脊椎动物胚胎发育和器官分化的最佳模型，在世界动物学研究史上一直占据着举足轻重的地位。目前对CTSD的研究主要集中在高等脊椎动物，而对其在相对比较原始的无颌类脊椎动物中的生物学功能，还尚不明确。 本研究通过对实验室前期构建好的七鳃鳗(Lampetra japonica)口腔腺cDNA文库中的3500多条有效EST序列进行搜索，获得一条与CTSD家族基因高度同源的EST序列。通过分子克隆手段，成功获得七鳃鳗CTSD基因(lamprey cathepsin D，L-CTSD)的cDNA全长序列1790 bp，其中3'非编码区472 bp，5'非编码区124 bp，开放阅读框1194bp，共编码397个氨基酸。通过生物信息学分析，发现L-CTSD基因编码的氨基酸序列由信号肽(Met1-Ala20)、前体域(Thr21-Ala48)和成熟域(Gln76-Va1396)三部分组成，含有一个潜在的N糖基化位点(Leu53)。氨基酸序列比对结果表明L-CTSD基因编码的氨基酸序列与尖吻鲈CTSD的氨基酸序列同源性高达70％，系统发育树结果表明七鳃鳗CTSD与爬行类、哺乳类CTSD的亲缘关系最近，符合从低等到高等、由简单到复杂的进化规律，但又自成一枝，具有独特的进化地位。利用实时定量PCR(Real-time quantitativePolymerase Chain Reaction，Real-time PCR)的方法，发现L-CTSD基因广泛分布于七鳃鳗的口腔腺、鳃、心脏、肝脏、肠、肾脏和免疫小体中。实验组七鳃鳗经大肠杆菌(Escherichiacoli，E.coli)和金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus，S.aureus)抗原刺激后，以上组织中L-CTSD基因的相对表达水平发生了明显上调，推测七鳃鳗CTSD可能与其营养摄取、免疫逃逸、个体发育等生理过程密切相关。进一步构建了原核表达载体pColdⅠ-CTSD，并在E.coli BL21中成功表达，通过组氨酸亲和层析柱纯化，获得电泳较纯的重组蛋白rL-CTSD(recombinant L-CTSD, rL-CTSD)。 L-CTSD基因的成功克隆表达，为下一步阐明CTSD在七鳃鳗体内的生物学功能奠定了坚实的理论和物质基础，同时也为研究脊椎动物的起源和进化做了重要的前期准备。

目录

声明

摘要

1 绪论

1．1 组织蛋白酶D的产生、合成、转运与激活

1．2 组织蛋白酶D参与多种体内生理学活动

1．2．1 组织蛋白酶D参与不同底物水解

1．2．2 组织蛋白酶D参与表皮分化

1．2．3 组织蛋白酶D参与细胞凋亡

1．3 组织蛋白酶D参与多种体内病理学活动

1．3．1 组织蛋白酶D与阿尔茨海默病

1．3．2 组织蛋白酶D与动脉粥样硬化

1．3．3 组织蛋白酶D与先天性肌肉萎缩

1．3．4 组织蛋白酶D与癌症

1．4 问题与展望

2 七鳃鳗CTSD基因的分子克隆

2．1 材料

2．1．1 实验动物

2．1．2 仪器设备

2．1．3 实验试剂

2．2 方法

2．2．1 引物设计

2．2．2 七鳃鳗口腔腺Total RNA的提取

2．2．3 七鳃鳗口腔腺cDNA模板制备

2．2．4 七鳃鳗CTSD基因的扩增

2．2．5 目的片段的回收

2．2．6 目的片段与T载体的连接及转化

2．2．7 阳性转化子的鉴定

2．2．8 重组质粒DNA小量纯化及测序

2．2．9 3’末端快速扩增反应

2．2．10 5’末端快速扩增反应

2．2．11 cDNA全长序列拼接及ORF片段扩增

2．3 结果

2．3．1 七鳃鳗口腔腺Toal RNA的提取

2．3．2 七鳃鳗CTSD基因的克隆及3’和5’末端快速扩增反应

2．3．3 七鳃鳗CTSD基因的cDNA全长的序列拼接及最终验证

2．4 讨论

2．5 小结

3 七鳃鳗CTSD的生物信息学分析

3．1 生物信息学分析所需软件和数据库

3．2 结果

3．2．1 七鳃鳗CTSD的理化性质分析

3．2．2 蛋白质二级结构和结构域分析

3．2．3 三级结构模拟

3．2．4 同源序列比对

3．2．5 保守基序分析

3．2．6 系统发育分析

3．3 讨论

3．4 小结

4 实时定量PCR法检测L-CTSD基因在七鳃鳗各组织中的表达谱

4．1 材料

4．1．1 实验动物

4．1．2 仪器设备

4．1．3 实验试剂

4．2 实验方法

4．2．1 免疫刺激

4．2．2 Total RNA的提取与检测

4．2．3 引物设计

4．2．4 Real Time PCR反应

4．3 结果

4．3．1 七鳃鳗各组织Total RNA的提取

4．3．2 L-CTSB基因在七鳃鳗不同组织中的相对表达谱分析

4．4 讨论

4．5 小结

5 pCold Ⅰ-CTSD表达载体的构建及重组蛋白的纯化鉴定

5．1 材料

5．1．1 实验材料

5．1．2 仪器设备

5．1．3 实验试剂

5．2 实验方法

5．2．1 引物设计

5．2．2 PCR扩增

5．2．3 目的片段的回收与双酶切

5．2．4 目的片段与载体的连接及转化

5．2．5 重组表达菌的鉴定

5．2．6 重组蛋白的诱导表达

5．2．7 表达菌的小量超声破碎

5．2．8 包涵体重组蛋白的提取和鉴定

5．2．9 包涵体纯化

5．2．10 包涵体透析复性

5．2．11 蛋白质浓缩

5．2．12 蛋白质浓度测定

5．2．13 质谱鉴定

5．2．14 rL-CTSD对牛血红蛋白的酶切活性检测

5．3 结果

5．3．1 pCold Ⅰ-CTSD表达载体的构建及测序

5．3．2 七鳃鳗CTSD蛋白的诱导表达与纯化

5．3．3 重组七鳃鳗CTSD的质谱鉴定

5．3．4 rL-CTSD对牛血红蛋白的酶切活性检测

5．4 讨论

5．5 小结

结论

本论文的创新点

参考文献

附录A 不同物种CTSD的FASTA格式氨基酸序列

附录B 表达载体pCoid Ⅰ质粒图谱

附录C BCA蛋白质浓度测定标准曲线

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致谢