转基因小麦边界序列的测定与品系鉴定方法的建立

摘要

背景:随着人类对转基因作物产品的需求不断加强，转基因作物产品陆续进入商业化，转基因作物的国际贸易与日俱增。世界各国都在积极制定有关转基因作物的法律、法规和标签制度，开展相应地生物安全评价及检测技术研究，以加强对商业化转基因作物及其产品的有效管控。这其中转基因作物检测技术作为设置、规避贸易壁垒和安全性评价的关键点，是转基因作物市场准入的重要保障基础。当前，在农作物产品国际贸易中，对农作物产品仅检测是否为转基因作物已经无法满足需要，还需要进一步鉴定转基因作物品系是否被进口国所批准（即需要进行转化事件的品系鉴定），另外，近年来在转基因作物贸易中还出现了转基因低水平混杂现象(low level presence，LLP)，以上这些问题的解决都急需建立先进可靠的检测技术方法作为保障，来满足日益发展的转基因作物商业化需要。
　　小麦是世界上主要粮食作物，其种植面积、总产量和总贸易额均居各类作物前列，但目前小麦已有产量及品质已经不能满足当前发展的需求，加上土地资源及环境因素等限制，转基因小麦的推广是解决问题之道。自转基因小麦诞生至今20多年，国内外学者应用转基因技术对小麦进行了大量研究，已在抗旱、抗虫、雄性不育、品质改良、抗病毒等方面取得了显著的成果，一些国家已经批准部分转基因小麦品系进入商业化推广。转基因小麦品系B73-6-1、B72-8-11b和B102-1-2是在1997年获得转化成功并稳定超表达的人工遗传转化小麦品系，具有改良小麦品质提高面筋含量、改善面粉烘烤品质等品性，目前上述3种转基因小麦品系已经批准进入环境释放但尚未进入商业化。
　　目的:本论文以转基因小麦B73-6-1品系、B72-8-11b品系和B102-1-2品系为研究对象，建立染色体步移测序技术破解转基因作物品系边界序列的新方法;测定3种转基因小麦品系边界序列信息;根据边界序列信息设计引物探针建立3种转基因小麦品系特异性检测的PCR方法、SYBR Green荧光和Taqman探针实时PCR方法。本研究建立的方法将达到对不同转基因小麦品系进行溯源鉴定能力，同时该项研究还将为其它转基因作物的品系鉴定及当前转基因作物商业化贸易中出现的LLP问题提供检测技术支持。
　　方法:提取转基因小麦B73-6-1、B72-8-11b和B102-1-2品系的基因组DNA，根据已知的3种转基因小麦品系基因信息，合成外源基因元件检测引物，以3种转基因小麦品系基因组DNA为模板，对可能存在的外源基因元件进行扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，对扩增条带回收测序，获得各外源基因元件的序列，再将外源基因上设计的引物交叉配对进行PCR扩增，扩增各个元件基因之间的序列，对扩增产物回收测序，然后根据获得的已知序列设计引物，利用染色体步移技术向序列两侧扩增转基因小麦品系外源片段序列和外源片段与小麦染色体重组的边界序列。将获得的全长序列与Genbank中的序列信息进行比对分析，确定各外源基因元件、外源片段序列和外源片段与小麦染色体重组的边界序列。依据分析的边界序列为基础，在转基因小麦品系的外源片段和小麦内源染色体序列上设计引物，对转基因小麦进行品系特异性检测，建立转基因小麦品系的PCR、实时PCR特异性检测方法。以多种转基因小麦、转基因玉米、转基因大豆、转基因稻米、非转基因小麦样品为检测对象进行检测，验证检测方法的特异性。以实时荧光PCR鉴定B73-6-1品系为例进行灵敏性实验。
　　结果:外源基因元件扩增电泳结果表明转基因小麦B73-6-1、B72-8-11b和B102-1-2品系含有NOS、bar、uidA、ubiquitin外源基因。外源基因元件之间扩增测序结果表明ubiquitin F/uidA R之间的序列与PCR特异性扩增的结果相一致，即:成功获得了外源基因ubiquitin和uidA之间的序列。染色体步移测序技术最终获取了转基因小麦B73-6-1、B72-8-11b和B102-1-2品系的外源片段序列和外源片段与小麦内源染色体重组的边界序列，获得的外源片段序列覆盖了转入的外源基因的全部序列，包括载体序列和转入的功能基因序列，外源片段与小麦染色体重组的边界序列经与NCBI比对，与AY494981.1同源性较高。根据转入的外源基因和小麦内源基因设计引物，对3种转基因小麦进行PCR、实时PCR品系特异性检测，以多种转基因小麦、转基因玉米、转基因大豆、转基因稻米、非转基因小麦样品为检测对象进行检测，结果只有目标转基因小麦品系能够检测出目的条带，CT值、扩增曲线及溶解曲线，其他样本无目的条带、CT值、扩增曲线及溶解曲线检出。以B73-6-1样品模拟制备10个含量梯度的添加样品进行灵敏度实验，检测灵敏度可达到0.01％(m/m)。
　　结论:本研究建立了染色体步移测序技术破解转基因作物品系边界序列的新方法，成功获得了转基因小麦B73-6-1、B72-8-11b和B102-1-2品系的边界序列信息，建立了转基因小麦B73-6-1、B72-8-11b和B102-1-2品系特异性检测的PCR、SYBR Green荧光和Taqman探针实时PCR检测方法，建立的方法特异性强、灵敏度高，操作易行，可快速准确地鉴定转基因小麦B73-6-1、B72-8-11b、B102-1-2品系。

目录

摘要

第一部分 引言

1 转基因生物的诞生与发展

1．1 基因工程的兴起和转基因生物的诞生

1．2 转基因生物的发展

2 转基因生物的种类

2．1 转基因微生物

2．2 转基因动物

2．3 转基因植物

3 转基因产品的应用领域

3．1 医药领域

3．2 食物领域

4 转基因工程产业的发展

5 转基因作物的发展与现状

5．1 转基因作物的主要类型

5．2 转基因作物的种类、分布、推广情况

5．3 转基因作物的安全性评价

5．4 转基因作物检测技术现状

6 转基因小麦发展现状

6．1 转基因小麦研究现状

6．2 转基因小麦的安全性及检测技术现状

6．3 小麦贸易现状及转基因小麦发展

7 本研究的目的与意义

第二部分 转基因小麦B73-6-1边界序列的测定与品系鉴定PCR检测方法的建立

1 材料和方法

1．1 实验材料

1．2 试剂和仪器

1．3 试验方法

2 结果与分析

2．1 外源基因元件的扩增和序列测定

2．2 外源基因元件之间序列的扩增和测定

2．3 染色体步移测定外源片段与小麦染色体重组的边界序列结果与分析

2．4 分析获取的全长序列

2．5 PCR特异性鉴定B73-6-1品系

3 讨论

4 结论

第三部分 转基因小麦B72-8-11b品系边界序列的测定与PCR检测方法的建立

1 材料和方法

1．1 实验材料

1．2 试剂和仪器

1．3 试验方法

2 结果与分析

2．1 外源基因元件的扩增和序列测定

2．2 外源基因元件之间序列的扩增和测定

2．3 测序结果与分析

2．4 PCR特异性鉴定B72-8-11b品系

3 讨论

4 结论

第四部分 转基因小麦B102-1-2品系边界序列的测定与PCR检测方法的建立

1 材料和方法

1．1 实验材料

1．2 试剂和仪器

1．3 试验方法

2 结果与分析

2．1 外源基因元件的扩增和序列测定

2．2 外源基因元件之间序列的扩增和测定

2．3 染色体步移测定外源片段与小麦染色体重组的边界序列结果与分析

2．4 分析获取的全长序列

2．5 PCR特异性鉴定B102-1-2品系

3 讨论

4 结论

第五部分 转基因小麦B73-6-1、B72-8-11b、B102-1-2品系鉴定SYBR Green实时PCR检测方法的建立

1 试验方法

1．1 模板DNA的定量检测

1．2 设计并合成PAGE级引物

1．3 Real-time定量PCR检测

2 试验结果

2．1 模板DNA的定量检测

2．2 引物设计结果

2．3 SYBR Green实时PCR检测结果

2．4 电泳验证结果

3 讨论

4 结论

第六部分 转基因小麦B73-6-1、B72-8-11b、B102-1-2品系鉴定Taqman探针实时PCR检测方法的建立

1 材料和方法

1．1 样品

1．2 DNA提取

1．3 引物和探针设计

1．4 实时荧光PCR反应

2 试验结果

2．1 转基因样品基因组DNA提取结果

2．2 Taqman探针实时PCR特异性检测结果

2．3 Taqman探针实时PCR灵敏度检测结果

3 讨论

4 结论

本论文的创新点

参考文献

附表

附录

博士期间学术成果情况

致谢

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