日本七鳃鳗Lyn-like的克隆表达、抗体制备及相关免疫学研究

摘要

Lyn是酪氨酸激酶Src家族成员之一，在细胞的生长、分化、迁移以及粘附等方面起到十分重要的作用。本研究首次在日本七鳃鳗中发现了Lyn的同源序列并对其进行基因克隆得到完整的开放阅读框（ORF），命名为Lyn-like。Lyn-like的ORF全长为1515bp，编码含有504个氨基酸残基的蛋白质。多重序列比对分析结果显示，Lyn-like和哺乳动物Lyn分子一样具有四个保守结构域（Src同源结构域4（SH4）、SH3、SH2、激酶结构域（PKC））和一个可变的独特结构域（UD）。尽管Lyn-like与哺乳动物的Lyn和Hck均有较高的序列相似性，但是在独特结构域中Lyn-like与Lyn的同源性高于Hck的同源性。利用从基因库中搜索出鱼类到哺乳类各个分类阶元动物的Lyn和Hck序列构建了系统进化树，结果表明Lyn和Hck主要分成两大聚类群，Lyn-like作为一个单分支被聚类到Lyn聚类群中。这些结果表明Lyn-like是Lyn而不是Hck的同源物。实时荧光定量PCR表明Lyn-like在mRNA的水平上主要在七鳃鳗免疫相关组织中表达，并且发现混合菌刺激后的单个核白细胞和髓样小体中Lyn-like的表达量显著上调，这与在蛋白水平上免疫印迹检测的结果一致。免疫荧光实验表明，Lyn-like蛋白作为一种胞质蛋白，在可变淋巴受体VLRB+淋巴细胞亚群中表达。以上生物学功能实验结果表明，Lyn-like可能在七鳃鳗的VLRB+介导的适应性免疫应答中发挥着重要作用。

目录

声明

第1章 绪论

1.1 Lyn的分子结构特点

1.2 Lyn的调节模式

1.3 Lyn在BCR介导的信号通路中的作用

1.4 Lyn与疾病的关系

1.5 Lyn与癌症的关系

1.6 小结

第2章 七鳃鳗Lyn-like的分子克隆及生物信息学分析

2.1 七鳃鳗Lyn-like的分子克隆

2.2 Lyn-like编码氨基酸序列的生物信息学分析

2.3 讨论

2.4 小结

第3章 七鳃鳗Lyn-like蛋白原核重组表达与蛋白纯化

3.1材料

3.2方法

3.3结果

3.4 讨论

3.5 小结

第4章 七鳃鳗Lyn-like重组蛋白多克隆抗体制备及其鉴定

4.1兔源Lyn-like多克隆抗体的制备

4.2 ELISA法检测兔源Lyn-like多克隆抗体的效价

4.3兔源Lyn-like多克隆抗体的纯化

4.4 免疫印迹技术检测多克隆抗体的特异性

4.5 实验结果

4.6讨论

4.7小结

第5章 七鳃鳗Lyn-like在组织中的表达及相关免疫学研究

5.1 七鳃鳗Lyn-like的mRNA在各组织中的相对表达

5.2 Lyn-like相关免疫学鉴定

5.3 讨论

5.4 小结

结论

本论文的创新点

参考文献

附录A 不同物种的Lyn、Hck的FASTA格式氨基酸序列

附录B pET-32a质粒图谱

附录C 蛋白质浓度测定标准曲线

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致谢