七鳃鳗L-CaM的分子克隆及组织、细胞分布的初步研究

摘要

钙调蛋白（calmodulin，CaM）是普遍存在于真核生物中的一类重要的Ca2+结合蛋白，其独特的EF-hand结构可以结合Ca2+。当Ca2+-CaM形成复合体后，才能和下游靶蛋白结合并激活下游激酶活性，进而行使相关细胞功能和生化反应。
　　本文从日本七鳃鳗（Lampetra japonica）神经轴体中提取RNA，通过PCR扩增获得全长序列为1592bp的L-CaM基因；生物信息学结果表明，L-CaM没有跨膜结构域和信号肽。成功构建pColdⅠ-L-CaM原核表达载体，获得可溶性的L-CaM重组蛋白；质谱结果证实了获得的重组蛋白是L-CaM；圆二色谱（circular dichroism,CD）分析发现，α-螺旋占89%，无β-折叠结构，无规则卷曲11%，说明L-CaM二级结构以ɑ螺旋为主；当外源加入Ca2+后α-螺旋减少至78%，β-折叠1%，无规则卷曲22%，说明Ca2+可以改变L-CaM二级结构的组成，且具有相互作用。成功构建pEGFP-N1-CaM真核表达载体，确定了L-CaM定位于HeLa细胞核和细胞浆中，LPS和Ca2+刺激影响L-CaM由细胞核向细胞中转移。实时定量PCR和免疫印迹结果表明，在293T细胞中，过表达的L-CaM对下游激酶CaMKⅡ作用不明显，但促进PLA2表达；免疫组化及免疫印迹结果表明，L-CaM在肠、神经轴体、肾、鳃中高表达。
　　综上所述，Ca2+-L-CaM复合体形成后活化L-CaM，激活下游靶蛋白和激酶的活性，影响细胞周期的进程，调节机体免疫功能。此外，CaM在细胞增殖、周期调控、凋亡等方面具有重要调节作用，而在七鳃鳗中L-CaM有何功能还未曾报道过。本文通过对L-CaM分子结构、组织定位等研究，为后期L-CaM的功能研究打下了坚实的基础。

目录

声明

第1章 引言

1.1 CaM的结构

1.2 CaM与靶蛋白的结合

1.3 CaM的细胞生物学功能

1.4研究七鳃鳗中CaM的意义

第2章 日本七鳃鳗L-CaM分子克隆及生物信息学分析

2.1 材料

2.2 实验方法

2.3 结果

2.4 讨论

第3章 七鳃鳗L-CaM原核表达、蛋白纯化及鉴定

3.1 材料

3.2 方法

3.3结果

3.4 讨论

第4章 L-CaM真核表达载体的构建及免疫相关研究

4.1 材料

4.2 方法

4.3 结果

4.4 讨论

结论

参考文献

附录A 质粒酶切实验方法

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致谢