东北七鳃鳗TRAF6基因克隆、表达分析及亚细胞定位研究

摘要

为研究TRAF6在TLR信号介导的先天免疫中的调控作用,研究通过克隆技术获得了东北七鳃鳗(Lethenteron morii)TRAF6基因的cDNA全长,命名为LmTRAF6.利用实时荧光定量方法(qPCR)分析了Lm TRAF6在幼鱼和成鱼中各组织的表达情况以及在铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)感染后脂肪体、鳃、肠和肾组织在不同时间点的表达量变化.利用双酶切技术构建pEGFP-TRAF6重组质粒并转染HEK293T细胞,48h后进行荧光观察并拍照.结果表明,LmTRAF6的cDNA全长为2751 bp,开放阅读框(ORF)为1785 bp,编码594个氨基酸.其蛋白结构域高度保守,具有RING结构、两个锌指结构、环-环(Coiled-coil)α螺旋结构域和MATH结构域.通过系统进化树分析,发现LmTRAF6与哺乳类以及鱼类TRAF6的亲缘关系较近,与果蝇、中国对虾TRAF6的亲缘关系较远.qPCR结果显示,LmTRAF6在各组织中均有表达,在幼鱼的心脏、皮肤、鳃、肝中的表达量相对较高,而在肠中表达量相对较低.在成鱼的肾、鳃、肌肉中的表达量相对较高,而在心脏中表达量相对较低.成鱼LmTRAF6在铜绿假单胞菌感染后,鳃、肠和肾的表达量在24h达到峰值.细胞定位显示,LmTRAF6在HEK293T的细胞质和细胞核中均有表达.以上结果为进一步探究七鳃鳗中TRAF6在TLR信号通路中的作用奠定了理论基础.