新型微量复杂样品连续电泳预分离方法研究

摘要

蛋白质作为后基因组时代生命科学的重要研究内容，已成为当今的研究重点及热点。目前对于蛋白质的研究还存在着一定的挑战，其主要原因在于待检测样品中所含有的蛋白质组成复杂，且其中某些蛋白质含量低，给分析检测带来了很大困难。解决如上困难的途径之一是对蛋白质样品进行分离及浓集。自由流电泳是一种独特的电泳分离方法，不仅分离条件温和，还可进行连续分离，十分适用于蛋白等复杂生物样品的预处理。本文介绍了一种新型芯片自由流电泳装置，通过引入离子交换膜为电泳分离的同时利用浓度极化效应进行浓集提供了条件。
　　第一章对自由流电泳分离原理及其应用以及微纳流控及涡流现象，离子交换膜和蛋白质组学进行了介绍和综述。
　　第二章利用聚甲基丙烯酸甲酯（有机玻璃，PMMA）基材制作了一种自由流电泳芯片系统，并对芯片结构进行了一系列改进。利用改进后的芯片对三种荧光探针分子混合物进行了分离，分离效果良好。对该芯片分离浓集性能进行了表征，包括缓冲液浓度、电压、加电方式、分离室高度等对分离浓集现象的影响，并对分离时电流-电压曲线进行了测定及对分离组分的电导率及pH进行了测定。实验结果表明，该芯片装置在正向加电（阳极-阳离子交换膜-阴离子交换膜-阴极）时具有良好的分离效果，反向加电（阴极-阳离子交换膜-阴离子交换膜-阳极）时在离子交换树脂界面出现离子耗尽和涡流现象。系统在如上两种加电模式下均表现出一定的浓集能力。用所建立的分离浓集装置对蛋白质混合样品（胃蛋白酶pI1.5-2.5、牛血红蛋白pI6.9及溶菌酶pI11.0）进行了分离，并在实验过程中使用羟乙基纤维素对分离室内壁进行了处理，避免了蛋白吸附沉积现象的出现。对蛋白质分离结果使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行表征。
　　初步研究结果表明，该装置在微量复杂蛋白质混合物的分离及浓集中有一定的潜力，预计在低浓度荷电组分以及生物大分子在线样品预处理过程中有较好的应用前景。

目录

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摘要

第1章 绪论

1．1 引言

1．2 自由流电泳

1．2．1 原理及特点

1．2．2 分离模式及其原理

1．2．3 芯片自由流电泳及其应用

1．2．4 自由流电泳在蛋白质组学中的应用

1．3 微纳流控

1．3．1 微流控与纳流控

1．3．2 浓度极化理论

1．3．3 流体的涡流现象

1．4 离子交换膜及其应用

1．4．1 离子交换膜

1．4．2 离子交换膜的应用—电渗析

1．5 蛋白质组学及其主要技术

1．6 本课题的研究意义和思路

第2章 芯片自由流微纳流控系统的建立及表征

2．1 引言

2．2 仪器与试剂

2．2．1 实验仪器

2．2．2 实验材料及试剂

2．2．3 溶液的配制

2．3 实验操作

2．3．1 芯片制作

2．3．2 简易荧光成像系统

2．3．3 芯片FFZE分离浓集荧光探针混合物

2．3．4 分离浓集产物pH及电导率的测定

2．3．5 芯片自由流电泳蛋白分离操作

2．3．6 SDS-PAGE凝胶电泳操作

2．4 结果与讨论

2．4．1 芯片自由流微纳流控系统的建立

2．4．2 芯片性能表征

2．4．3 蛋白质混合物分离

2．5 本章小结

第3章 结论与展望

参考文献

致谢