人NMDA受体主亚基M3-M4环的原核表达、纯化与鉴定

摘要

该课题组通过生物信息学方法对人NMDAR主亚基(NR1)上受体激活相关多肽片段的理化特性、抗原性及自身免疫原性等进行分析之后,确定NR1膜蛋白胞外区M3-M4环靶片段更易成为NMDAR免疫干预的分子靶点.以此为靶点采用免疫干预的方法来调控NMDAR的激活状态,进而有望建立安全、可行的兴奋毒性脑损害免疫防治的方法.人NR1膜蛋白M3-M4环靶片段是由163个氨基酸组成的多肽,相对分子质量为18800,该研究采用基因工程方法获得该肽段,以用于进一步免疫原性及相关应用研究,为兴奋性脑损害免疫干预提供实验基础.该研究以人脑胶质瘤组织总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增出人NMDAR主亚基M3-M4环的基因片段,并成功构建了原核表达载体pBV-NR1L3.同时,按照计算机辅助原核表达载体pBV220中外源基因高效表达的数学模型预测方法,将PCR引物进行优化改构,从而实现了目的基因的高效表达,并对表达产物进行了纯化和鉴定.凝胶扫描分析表达量约占菌体总蛋白29﹪,蛋白纯度达95﹪以上.该研究解决了下一步研究所需的免疫原来源问题,为免疫干预NMDAR治疗兴奋毒性脑损害打下了重要基础.

目录

前言

材料

方法

一、胶质瘤组织总RNA的提取

二、RT-PCR方法扩增目的基因

三、原核表达载体pBV-NR1L3的构建

四、重组质粒pBV-NR1L3在大肠杆菌中的诱导表达

五、表达产物的纯化

六、表达产物的鉴定

结果

讨论

结论

致谢

参考文献

附录

综述

一、NMDA受体通道亚基

二、NMDA受体的药理学特性

三、表达调控

参考文献

缩略词表