人NMDA受体主亚基M3M4环靶片段自身免疫抗兴奋毒性神经保护研究

摘要

脑血管疾病、脑外伤、脑肿瘤及其继发的脑内综合征(如脑心综合征、消化道出血等)、焦虑、抑郁、疼痛、癫痫、痴呆等重大神经、精神疾患，尽管发病原因各异，但其发生、发展均被证明与N-甲基-D-门冬氨酸受体(NMDAR，NR)异常有一定关联。试图通过选择性干预NMDA受体过度激活所介导的神经兴奋毒性，为上述若干致死、致残性疾患提供有效的防治手段，是近20多年以来基础与临床神经科学研究始终追求的一个重要目标。然而这种努力至今尚未在临床上取得相应成功。其原因可能至少有二：(1)已有NMDA受体拮抗剂或阻断剂的应用“空间窗”过大。NMDA受体在神经系统内分布广泛，具有重要生理功能。以往所检验的NMDA受体拮抗剂或阻断剂均能弥散通过血脑屏障，所以不仅作用于受累脑区的NR靶点，还会广泛影响未受累脑区的重要功能，这应该是导致“天使粉”苯环己哌啶(PCP)与Dizocilpine(MK-801)等显示有严重毒副作用因而难以进入临床的一个主要原因。(2)应用“时间窗”过小。众所周知，神经元可逆性损害的“时间窗”短至数小时、数分甚至数秒，因此通常情况下，有效的神经保护药物难以得到适时使用，不可逆性损害阶段予以应用，显然为时已晚。这种客观上的使用“延迟”可能是导致现有NMDA受体拮抗剂临床应用失败的又一重要原因。 对上述若干脑疾患高危人群予以NR自身免疫接种有望解决这两个重要的障碍性问题，NMDA受体干预研究因此可望取得新的突破：(1)治疗“空间窗”缩小。在无疾病的健康状态下，针对自身NR的循环抗体因血脑屏障的限制无法进入作用靶区，而缺乏血脑屏障的脑区恰恰又是非NR富集区和非NR主要工作区，因此对高危人群予以预防性免疫接种，其循环抗体不会对正常人体的生理功能产生明显的影响。而对疾病状态下的受累脑区，局部血脑屏障开放，循环抗体选择性地进入其中，有限地作用于局部过度激活的分子和细胞靶点，由此产生预期的治疗或预防效应。血脑屏障开放度越小，这种选择性干预作用便越小。反之，局部受累脑区损伤越重，其血脑屏障开放程度越大，自身NR循环抗体的特异性干预效应也会越大。(2)治疗“时间窗”延长。特异性循环抗体在疾病发生前或发展中既已存在，一旦疾病发生或进一步发展，受累脑区血脑屏障开放度加大，循环抗体会随之自动进入相应脑区而发挥直接的干预作用，NR过度激活所造成的不可逆性神经元损害因此会得到有效延缓。同时，由于治疗“时间窗”被客观延长，其它任何有效的急救手段也将因此赢得更多的应用时机。为探讨建立这种“兴奋毒性脑损害免疫防治”全新策略的可能性，我们以人NR主亚基(NR1)重要异型NR1a胞外区受体激活相关靶片段为对象进行了下述研究：一、人NR1a胞外区受体激活相关靶片段表位分析采用生物信息学方法对人NMDAR主亚基NR1a上两个受体激活相关多肽片段P1(第一跨膜域前)、P2片段(第三、四跨膜域之间即M3M4环的主要部分)的理化特性与抗原性进行了分析。用GOLDKEY软件分别选取公认的Hopp等与Kyte等亲水性参数、Jain表面可及性参数、Karplus-Schulz主链柔韧性参数及Welling抗原性参数对P1、P2两个多肽片段进行多参数分析。并采用通用的Prosite程序与Chou-Fasman方法比较分析P1、P2多肽片段的氨基酸组成与二级结构特征。综合判定两个多肽片段的抗原性及其表位特征，结果发现P2抗原性强于P1，可能更容易成为免疫干预的靶片段。以GluR2亚基相应功能域晶体结构为模板，同源模建靶片段的空间构象，对获得的初始构象进行分子力学优化，调整获得稳定结构，分析空间构象上P2靶片段的表观静电分布、二级结构与亲水性，进一步分析空间构象上靶片段的B细胞表位特征。P2多肽片段上可能共存在7个B细胞表位，从氨基端开始依次是FLVLDRPEERI、RLRNPSDKFIYAT、YRHMEKHNYES、RDNKLHAFIW、ASQKCDLVTT、KDSPWKQNVS、ILKSHENGF，分布较均匀，包含有受体激活相关重要位点或与其距离较近。 二、人NR1aM3M4环靶片段的原核表达、纯化与鉴定用Trizol试剂抽提新鲜脑胶质瘤组织总RNA，经紫外分光光度计测定RNA溶液260nm及280nm的读数，以进行RNA定量及纯度鉴定。以总RNA的mRNA为模板，利用3'引物或其它下游引物进行逆转录反应；然后利用所合成的靶片段上、下游引物扩增出NR1aM3M4环的基因片段。为提高外源基因表达水平，按照计算机辅助原核表达载体pBV220中外源基因高效表达的数学模型预测方法，优化改构设计PCR上游引物。其中RNA二级结构预测及局部密码子偏性计算分别由RNAfold软件和Goldkey软件完成，并保证改构后引物与原始引物具有相同的酶切位点。用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ分别消化目的基因和表达质粒pBV220，通过T4DNA连接酶进行连接，构建表达质粒pBV-NR1L3。用表达质粒转化感受态大肠杆菌DH5α，通过酶切鉴定筛选阳性克隆，并以双脱氧末端终止法对提取的表达质粒进行基因测序。升高培养温度至42℃诱导重组质粒pBV-NR1L3在大肠杆菌中的表达，取诱导表达不同时刻菌体进行SDS-PAGE，以确定最佳诱导时间，并通过凝胶薄层扫描分析，确定目的蛋白占菌体蛋白的百分含量。同时取表达量最高时刻的菌液离心收集菌体，冰浴超声破碎，通过SDS-PAGE，观察蛋白表达形式。在制备性SDS-PAGE基础上，电洗脱从胶片上切下的目的条带，使用透析法进行包涵体复性，通过冰干法，获得纯品粉末。使用SDS-PAGE、Western印迹以及肽质谱指纹分析等方法从相对分子质量、免疫反应性、蛋白质一级结构等方面进行分析鉴定，最终确定表达蛋白即为目的蛋白。 三、人NR1aM3M4环靶片段特异性单抗表位分析为了进一步获得M3M4片段的表位信息，我们以单克隆抗体MAB363(识别表位位于人NR1a分子M3M4环)淘筛噬菌体展示随机12肽库，对筛选克隆进行特异性ELISA检测和竞争结合实验分析，从30个克隆中得到一个阳性克隆序列“VHTNPSTWQPIL”(克隆1)；原核表达的NR1aM3M4环可以与克隆1竞争结合MAB363；结合生物信息学预测结果，固相合成5个表位探针短肽，发现其中只有R(22)LRNPSKD可以与M3M4环竞争结合抗体，将NPS三个氨基酸残基逐一敲除，缺失N或NP的合成肽和M3M4环竞争抗体的能力减弱，缺失NPS的合成肽完全没有竞争能力。提示NPS可能是NR1膜蛋白M3M4环靶片段上一个重要的B细胞表位(主表位)，其序列或构象特征，特别是其中S残基在原子水平上的某种特征(另两个阳性克隆序列均含有SPPL残基)，可能为生物信息学预测表位RLRNPSDKFIYAT以及噬菌体展示肽VHTNPSTWQPIL的免疫反应原性所必需。 四、人NR1aM3M4环靶片段小鼠免疫及其抗血清抗兴奋毒性作用与机制研究:(一)M3M4靶片段免疫应答检测。(二)M3M4靶片段抗血清抗兴奋毒性损害作用.(三)单克隆抗体MAB363抗兴奋毒性损害作用。(四)单克隆抗体MAB363抗兴奋毒作用机制探讨1、探讨抗体保护与神经元钙离子内流的关系。2、采用傅里叶变换红外光谱(FTIR)技术，对不同处理后的海马细胞红外光谱特性进行比较。 综上所述，利用生物信息学预测得出人NR1aM3M4环靶片段上存在若干B表位，容易成为免疫干预的靶点；以人脑胶质瘤组织总RNA为模板，采用RT-PCR方法扩增出人NR1aM3M4环靶片段基因，并成功构建了原核表达载体pBV-NR1L3。同时，按照计算机辅助原核表达载体pBV220中外源基因高效表达的数学模型预测方法，将PCR引物进行优化改构，从而实现了目的基因的高效表达，并对表达产物进行了纯化和鉴定。凝胶扫描分析表达量约占菌体总蛋白29％，蛋白纯度达95％以上。以单抗MAB363筛选噬菌体随机展示肽库，结合表位肽竞争性ELISA分析获得其识别表位，且与生物信息学预测结果吻合，提示该表位可能是NR1a膜蛋白M3M4环靶片段上一个重要的B细胞表位；进一步的动物实验证明M3M4环重组肽具有免疫原性，阳性血清和单抗MAB363具有体外抗兴奋毒作用，其机制可能与影响膜受体二级结构、抑制钙离子内流有关。以上工作为免疫干预NMDAR治疗兴奋毒性神经损伤打下了重要基础。

目录

英文字母缩写词表

前 言

第一部分人NR1a胞外区受体激活相关靶片段表位分析

材料与仪器

方法

结果

讨论

参考文献

第二部分人NR1a M3M4环靶片段的原核表达、纯化与鉴定

材料与仪器

方法

结果

讨论

参考文献

第三部分人NR1a M3M4环靶片段特异性单抗表位分析

材料与仪器

方法

结果

讨论

参考文献

第四部分人NR1aM3M4环靶片段小鼠免疫及其抗血清抗兴奋毒性作用与机制

材料与仪器

方法

(一)M3M4蛋白免疫效应检测及抗血清的制备

(二)免疫血清体外抗兴奋毒性实验

(三)单克隆抗体MAB363抗兴奋毒性损害作用

(四)单克隆抗体MAB363抗兴奋毒作用机制探讨

结果

(一)CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群的变化(Tab.1,Fig.1)

(二)细胞因子检测

(三)多抗血清效价检测

(四)体外抗兴奋毒性保护实验

(五)单克隆抗体MAB363抗兴奋毒性作用

(六)单克隆抗体MAB363抗兴奋毒作用机制探讨

讨论

参考文献

结论

致谢

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