E1A激活基因阻遏子调控体外培养人血管平滑肌细胞表型转化

摘要

本研究初步探讨CREG基因调控人VSMCs表型转化的分子机制。 实验方法： (1)以带绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)的空载体pLNCX(+)/GFP为对照，用磷酸钙共沉淀法将正义CREG逆转录病毒表达载体[pLNCX2(+)/CREG]、反义CREG逆转录病毒表达载体[pLXSN(-)/CREG]及pLNCX(+)/GFP感染293细胞，包装出完整的逆转录病毒后，感染HITASY细胞，经G418筛选，获得稳定感染的细胞克隆。 (2)应用免疫荧光染色、Westernblot等方法检测感染前后HITASY细胞中CREG蛋白和平滑肌分化标志蛋白SMα-actin的表达和定位。 (3)应用倒置相差显微镜观察感染前后HITASY细胞的形态学改变。 (4)应用Westernblot法检测感染前后CREG蛋白对SMα-actin相关调控因子-RhoA表达的调控。 (5)应用免疫荧光染色，总蛋白、核蛋白及浆蛋白的Westernblot等方法检测感染前后CREG蛋白对SMα-actin相关调控因子-SRF的表达和定位的调控。 (6)以Rho激酶特异性抑制剂Y-27632作用pLNCX2(+)/CREG细胞后，Westernblot法分析SMα-actin的表达及SRF的核转位。 (7)应用免疫共沉淀分析感染前后细胞无血清培养基中CREG蛋白的分泌表达及CREG与6-磷酸甘露醇胰岛素样生长因子Ⅱ受体(insulin-likegrowthfactorⅡ/mannose6-phosphatereceptor，M6P/IGF2R)的相互作用关系。 (8)以蛋白磷酸酶PP2A特异性抑制剂okadaicacid(OA)减少M6P/IGF2R在细胞膜表面分布后，应用Westernblot等方法检测OA对CREG基因诱导的RhoA、SRF、SMα-actin蛋白表达的影响。 (9)以细胞计数法、BrdU掺入法及流式细胞分析方法检测感染前后HITASY细胞的增殖能力。 (10)采用荧光显微镜下观察DAPI染色后凋亡细胞核形态，AnnexinV/PI流式细胞术检测细胞的凋亡率以及RT-PCR技术分析凋亡相关基因Caspase-9mRNA的表达，判定细胞的凋亡情况。 (11)Westernblot分析感染前后p38丝裂原活化蛋白激酶(p38mitogen-activatedproteinkinase，p38MAPK)和磷酸化p38MAPK(phosphorylatedp38MAPK，p-p38MAPK)的表达变化，并以SB203580阻断p38MAPK信号通路后检测细胞的凋亡情况。 实验结果： (1)将重组逆转录病毒表达载体pLNCX2(+)/CREG及pLXSN(-)/CREG用磷酸钙共沉淀法分别感染HITASY细胞后，以正常HITASY细胞为空白对照，用免疫荧光染色和Westernblot法观察与空白对照组相比感染前后的HITASY细胞中CREG蛋白的表达。结果表明感染pLNCX2(+)/CREG的HITASY细胞CREG蛋白表达明显上调；而感染pLXSN(-)/CREG的HITASY细胞其CREG蛋白表达下调。 (2)感染前后HITASY细胞的形态学和生长特性的改变。正常HITASY细胞呈典型的波峰波谷样生长，去血清培养后细胞变细长呈长梭形；pLNCX2(+)/CREG稳定感染的HITASY细胞体积变小且更加细长，易于环绕排列生长呈管腔样结构，细胞呈现典型的分化表型生长，去血清后细胞形态无明显改变；pLXSN(-)/CREG稳定感染的细胞体积明显增大，细胞失去极性呈无序样生长，去血清培养后，细胞未呈现分化状态，反而不耐受饥饿而出现大量死亡现象。 (3)感染前后CREG蛋白对SMα-actin及其相关调控因子-RhoA和SRF的表达和定位的调控。pLNCX2(+)/CREG稳定感染细胞中SMα-actin表达显著增加，同时SRF入核转位，RhoA总蛋白表达上调，而pLXSN(-)/CREG稳定感染的细胞SMα-actin蛋白表达显著降低，同时伴有SRF出核转位及RhoA总蛋白表达下调。 (4)Y-27632对CREG蛋白介导的SRF入核转位的影响。pLNCX2(+)/CREG稳定感染的细胞以Rho激酶特异性抑制剂Y-27632作用后，CREG诱导的SMα-actin表达下调的同时SRF出核转位。 (5)免疫共沉淀分析发现，CREG蛋白能被分泌到VSMCs培养基中表达，并可与细胞膜受体M6P/IGF2R发生直接相互作用。经OA作用减少M6P/IGF2R在细胞膜表面分布可明显抑制CREG蛋白过表达引起的RhoA、SRF和SMα-actin表达。 (6)感染前后HITASY细胞增殖和凋亡能力的改变。CREG蛋白过表达明显抑制HITASY细胞增殖，同时也抑制血清饥饿诱导的细胞凋亡的发生；而CREG表达抑制后HITASY细胞增殖能力和自然凋亡能力均显著增加。 (7)p38MAPK信号通路对CREG蛋白调控VSMCs凋亡的影响。pLNCX2(+)/CREG稳定感染的细胞p38MAPK、p-p38MAPK的表达增加，而pLXSN(-)/CREG稳定感染的细胞p38MAPK、p-p38MAPK表达显著下降。SB203580阻断p38MAPK信号传导通路后，CREG过表达引起的细胞凋亡抑制作用被明显减弱，血清饥饿后CREG过表达的HITASY细胞中细胞凋亡现象明显增加。 研究结论：在体外培养的人VSMCs中，CREG可能作为一种分泌型蛋白质通过与细胞膜受体M6P/IGF2R相互作用，依次激活SMα-actin蛋白相关调控因子RhoA和SRF从而引起SMα-actn表达增加，促进VSMCs向分化表型转化。同时CREG过表达明显抑制VSMCs的增殖及细胞凋亡的发生，CREG对VSMCs凋亡的抑制作用可能与p38MAPK信号转导通路活化有关。

目录

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摘要

前言

第一部分E1A激活基因阻遏子诱导人VSMCs分化

第二部分E1A激活基因阻遏子抑制人VSMCs增殖和凋亡

讨论

小结

结论

致谢

参考文献

综述 E1A激活基因阻遏子的研究进展

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