参杞合剂对人鼻咽癌细胞CNE凋亡及转移的影响

摘要

目的：肿瘤的治疗仍然是医学的一大难题。目前，对肿瘤治疗方法的研究很多，传统中医中药在治疗方面有很大优势，关于这方面的研究也日趋广泛和深入。中药复方制剂参杞合剂(SQ)是在传统中药参杞片的基础上辅以黄芪、当归、莪术、白花蛇草煎制而成，其抗肿瘤的作用及机制的初步探讨已见报道，研究表明SQ在小鼠体内外均有显著的抑瘤作用。本实验通过研究参杞合剂(SQ)对人鼻咽癌细胞CNE的凋亡及转移的影响，进一步探讨对人类肿瘤作用的相关机制，这对研制高效低毒的抗瘤新药，具有重要意义。 方法：取体外培养的CNE细胞，加入不同浓度的参杞合剂(0.03125～0.5g生药/ml)，培养不同时间(24h、48h、72h)后，MTT法计算抑瘤率。CNE细胞连传两代后，调整细胞浓度为5×105，加入不同浓度的参杞合剂(31.25mg/ml、62.50mg/ml、125.00mg/ml)各1ml，对照组加入等量的生理盐水，作用48h，分做以下试验。取浓度为62.50mg/ml试验组肿瘤细胞，提取DNA，经1﹪的琼脂糖凝胶电泳后，在凝胶成像系统下观察凋亡细胞形成的DNA条带。取三个作用浓度的细胞，试验组加入Fas-FITC单抗5μl，对照组加入同型单抗5μl，采用流式细胞术检测细胞表面Fas的表达情况。提取浓度为31.25mg/ml及62.50mg/ml作用的肿瘤细胞的RNA，计算RNA的浓度及纯度，设计并合成caspase-3、血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)及内参照β-actin的上游引物和下游引物，以提取的mRNA为模板，按照试剂盒说明在PCR仪中进行RT-PCR反应，产物经琼脂糖凝胶电泳后，在凝胶成像仪下显示结果，运用1abwork30.软件分析结果，检测试验组和对照组caspase-3和血管内皮生长因子(VEGF)的表达的差异。 结果：1.参杞合剂(SQ)对CNE细胞体外作用的结果五个不同浓度的SQ对CNE细胞具有明显的直接杀伤作用，其作用强度在一定范围内呈现出对浓度和时间的依赖性。随时间延长和浓度增加，其抑瘤作用逐渐增强。 2.SQ对CNE细胞凋亡的影响经不同浓度SQ作用48小时后，流式细胞仪检测CNE细胞表面的Fas表达上调，并呈剂量依赖性，随剂量的增加平均荧光强度由28.49±1.04升至63.65±1.09，经统计学分析，各组与对照组相比差异显著(P＜0.05)。31.25mg/ml及62.50mg/ml两个浓度的SQ能使凋亡关键性蛋白caspase-3表达增加，随剂量的升高琼脂糖凝胶电泳条带变粗变亮，caspase-3与内参照光密度积分值之比(capase-3/β-actin)由0.228±0.012升至0.674±0.028，两用药组与对照组相比，均具有显著性差异(P＜0.05)。提示SQ能够影响Fas/FasL这一死亡受体和配体介导的凋亡途径中的蛋白表达。琼脂糖凝胶电泳可以检测到62.50mg/ml的SQ对CNE细胞凋亡的影响，表现为可观察到较清晰的凋亡特征性梯形条带。 3.SQ对CNE细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响能够下调血管内皮生长因子(VEGF)的表达，这种下调作用呈现剂量依赖性，随浓度的增加，血管内皮生长因子(VEGF)mRNA条带变细变暗，对照组和SQ浓度为31.25、62.5mg/ml组与内参照光密度积分值之比(caspase-3/β-actin)分别为0.674±0.028、0.425±0016、0.228±0.012，有随浓度增加而下降的趋势，两用药组和对照组之间均有显著性差异(P＜0.01)。 结论：检测的指标表明：SQ在体外能够直接抑制肿瘤细胞增殖。SQ具有诱导体外培养的CNE细胞凋亡的作用。琼脂糖凝胶电泳结果显示，SQ能使肿瘤细胞DNA断裂，形成特征性的凋亡梯形条带。SQ提高CNE细胞表面分子Fas的表达水平，并且对重要的凋亡相关蛋白caspase-3的表达具有上调作用，提示SQ致细胞凋亡的作用点为Fas/FasL这一死亡受体和配体结合引发的细胞凋亡途径上的关键蛋白。RT-PCR试验证实了SQ具有下调肿瘤细胞血管内皮生长因子(VEGF)的作用，提示SQ可以抑制肿瘤细胞转移，其作用途径及机制需进一步探讨。

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摘要

前言

材料和方法

实验结果

讨论

结论

致谢

参考文献

综述 中药抗肿瘤作用的分子机制进展