Notch1信号通路在大鼠、成人乳腺上皮干细胞分化中的作用

摘要

本实验诱导大鼠乳腺增生性疾病模型，应用免疫组化和RT-PCR方法检测Notch1蛋白和mRNA在大鼠乳腺增生性疾病中的表达；收集乳腺手术标本，检测Notch1信号通路、乳腺上皮干细胞标记物CK5、腺腔细胞标记物CK8、肌上皮细胞标记物P63在10例正常乳腺组织、20例乳腺增生症、14例非典型增生、6例导管原位癌及48例浸润性导管癌中的表达，探讨Notch1信号通路在大鼠和成人乳腺上皮干细胞分化和演变中的作用，揭示乳腺上皮干细胞分化及发生恶性转化时演变规律和机制。 研究方法： 1.通过DMBA灌胃方法诱导大鼠乳腺增生性疾病模型；应用免疫组化和RT-PCR方法检测Notch1蛋白和mRNA在大鼠增生性疾病中的表达。 2.收集正常成人乳腺组织和乳腺导管上皮良、恶性增生疾病的组织标本标本，采用免疫组化方法，分别检测Notch1、CK5、CK8、P63在10例正常乳腺组织、20例乳腺增生症、14例非典型增生、6例导管原位癌及48例浸润性导管癌中的表达，通过分组进行对比分析和相关性分析。 研究结果： 1.应用DMBA成功诱导大鼠乳腺增生性疾病模型。诱导出13例乳腺非典型增生，4例乳腺导管癌。 2.Notch1在大鼠正常乳腺组织及增生性疾病中的表达。Notch1蛋白免疫组化阳性染色主要为胞膜和胞浆呈现棕黄色至棕褐色颗粒，主要表达于腺泡上皮。在5例正常大鼠乳腺组织全部表达，在13例大鼠乳腺非典型增生有6例表达，表达阳性率为46.2﹪，在4例大鼠乳腺导管癌有2例表达，表达阳性率为50﹪。在乳腺增生病、非典型增生和导管癌主要是增生的或恶变的导管上皮表现阳性改变。RT-PCR检测mRNA，正常和各增生性乳腺组织PCR产物在347bp处出现条带，但各条带灰度差别不明显。 3.Notch1在成人正常乳腺组织、乳腺增生病、导管上皮非典型增生、导管原位癌以及浸润性导管癌中的表达。在正常乳腺组织有8例(80﹪)表达，乳腺增生病有14例(70﹪)表达，导管上皮非典型增生有9例(64.3﹪)表达，在导管原位癌和浸润性导管癌分别有2例(33.3﹪)、15例(31.3﹪)表达，随着病变的演变表达呈下降趋势，浸润性导管癌与正常乳腺组织、乳腺增生病、导管上皮非典型增生比较有显著性差异p＜0.05。在浸润性导管癌，其表达与肿瘤的大小无关，但与肿瘤的分化相关p=0.009，随着肿瘤分化的降低，，表达逐渐下降。 4.P63在正常组织、乳腺增生病、导管上皮非典型增生、导管原位癌以及浸润性导管癌中的表达。P63在正常组织、乳腺增生病、导管上皮非典型增生全部表达于肌上皮细胞(100﹪)，而在导管原位癌有5例(83.3﹪)表现为肌上皮细胞全部及部分表达，48例浸润性导管癌有4例(8.3﹪)表达，呈现少量的肿瘤细胞阳性，并且主要是低分化的乳腺癌表达，Ⅰ级乳腺癌肿瘤细胞未发现有阳性染色。 5.CK5、CK8在正常乳腺组织、乳腺增生病、导管上皮非典型增生、导管原位癌以及浸润性导管癌中的表达。CK5主要表现为腺腔靠近基底处细胞胞浆阳性，CK5在正常乳腺组织、乳腺增生病等表达较高，分别为8例(80﹪)、13例(65﹪)、14例非典型增生有5例(42.9﹪)表达、6例导管原位癌2例(33.3﹪)表达、而在浸润性导管癌仅有12例(25﹪)呈现阳性。CK8主要表达于腺泡上皮的胞浆，与CK5表达相反，随着病变的演变，其表达逐渐增强，在浸润性导管癌有42例(87.5﹪)表达阳性，绝大部分浸润性导管癌37例(77.1﹪)呈现CK5-/CK8+、只有5例(10.4﹪)呈现CK5+/CK8-、5例(10.4﹪)呈现CK5+/CK8+、仅有1例呈现CK5-/CK8-，这种表达与肿瘤大小无关，但与肿瘤分化相关p＜0.05。 研究结论： 1.应用DMBA灌胃的方法可以成功诱导大鼠乳腺增生性疾病模型。 2.大鼠乳腺上皮干细胞分化过程中，Notch1表达逐渐下降，推测，在大鼠正常乳腺组织，Notch1信号通路抑制干细胞向腺腔方向分化，从大鼠乳腺增生病到乳腺癌，这种抑制作用逐渐减弱，最终形成以腺腔表型为主的乳腺癌。 3.在大鼠乳腺增生性疾病模型中，Notch1蛋白和mRNA表达趋于一致，因此Notch1表达的调节不在翻译水平，可能在转录水平。 4.在成人乳腺上皮细胞谱系分化的进程中，CK5的表达下调，最终缺失，被CK8取代；CK8在乳腺浸润性导管癌的标本中，CK8染色强时，CK5染色相对较弱；反之，亦然。说明乳腺上皮恶性转化时趋向腺系分化的方向发展。 5.在成人乳腺上皮细胞谱系分化的进程中，P63+的肌上皮细胞逐渐丢失，在乳腺浸润性导管癌的标本中P63+的肿瘤细胞，可能是由乳腺上皮委任干细胞分化为肌上皮中间细胞，然后发生恶性转化而来。 6.作为乳腺上皮干细胞免疫表型标记物的CK5、腺腔细胞标记物CK8和肌上皮细胞标记物P63表达结果的差异性提示：CK5+/CK8-表型的细胞是向腺上皮与肌上皮分化的祖细胞，即委任干细胞(committedstemcells)；CK5+/CK8+表型的细胞是腺中间细胞，可以分化为终末腺细胞；CK5-/CK8+表型的细胞则可能是纯粹的腺腔细胞；CK5+/P63+表型的细胞是肌上皮中间细胞，可以分化为肌上皮终端细胞。 7.在成人乳腺上皮细胞谱系分化的进程中，Notch1表达逐渐下降，与CK8表达趋势相同，因此推测，在正常情况下Notch1信号通路抑制乳腺上皮干细胞向肌上皮细胞系或腺腔细胞系过度分化，维持分化平衡；干细胞发生恶性转化时，平衡破坏，向腺腔方向分化增强，呈现“基底表型－混合型－腺腔表型”发展模式，这可能与Notch1信号通路对乳腺上皮干细胞向腺腔方向分化抑制作用减弱有关。

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摘要

实验第一部分：Notch1信号通路在大鼠乳腺上皮干细胞分化中的作用

实验第二部分：Notch1信号通路在成人乳腺上皮干细胞分化中的作用

综述 Notch信号通路与乳腺干细胞的分化

附图（1）

附图（2）

附图（3）